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第一部分:体外实验实验一大鼠胰岛的分离、培养及活性鉴定目的建立体外分离大鼠胰岛细胞的方法,评价及鉴定胰岛的数量及功能。方法1、采用胆总管穿刺灌注胶原酶P,Ficoll密度梯度离心法分离大鼠胰岛。2、采用DTZ染色,AO-PI双色荧光染色法及葡萄糖刺激试验鉴定胰岛数量及功能。结果SD大鼠胰岛呈不规则圆形,岛状,分离数量300-500IEQ/鼠,直径50-200um,DTZ染色呈猩红色,纯度＞9596,胰岛素刺激指数＞3.0。结论采用胆总管穿刺灌注胶原酶V型,Ficoll密度梯度离心法分离大鼠胰岛简便易行,所得胰岛得率及纯度高,活性正常。实验二大鼠骨髓间充质干细胞分离、培养及鉴定目的研究体外培养及扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法,并行功能鉴定。方法用DMEM完全培养液彻底冲洗骨髓腔,大鼠淋巴细胞分离液离心分离,取单个核细胞层体外以完全L-DMEM培养液贴壁培养至P4代,并进行成骨及成脂诱导。结果P4代BM-MSCS呈长梭形,单核,在含10%的胎牛血清中能稳定的贴壁生长,经成骨诱导,可出现钙盐沉积,分化为成骨细胞,经成脂诱导,可分化为脂肪细胞。结论采用密度离心及贴壁筛选法可获得大量均一、纯度高的大鼠骨髓间充质干细胞。实验三大鼠胰岛-骨髓间充质干细胞体外共培养的实验研究目的观察体外骨髓间充质干细胞是否具有延长胰岛存活时间的作用。方法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和胰岛,分共培养组(30IEQ+2×10~4个BM-MSCs)单独培养组(30IEQ),予体外培养,检测胰岛的存活率和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量(GSIS)。结果随体外培养时间的延长,胰岛与骨髓间充质干细胞混合培养组的存活率与胰岛单独培养组的存活率差异具统计学意义,P＜0.05,随培养时间延长,胰岛对葡萄糖反应性逐渐减弱,刺激指数从第1天的3.1～3.3降至第7天的1～1.6。结论体外共培养条件下,BM-MSCS可延长胰岛的存活时间。实验四建立I型糖尿病大鼠模型的实验研究目的建立大鼠I型糖尿病模型,评价其稳定性。方法健康SD大鼠16只禁食10h,随机分为对照及实验组,实验组按60mg/kg剂量向大鼠腹腔内注入2%浓度的STZ,注药后72h测血糖,随机血糖连续2次超过16.7mmol/L并稳定5d者选为糖尿病模型,对照组腹腔注射等量生理盐水。结果实验组一次建模成功SD大鼠8只,4周后随机血糖(24.4±1.7mmol/L),体重(283.3±32.1g),24h尿量(94.6±16.1ml);对照组血糖(7.1±1.1mmol/L),体重(455.0±33.7g),24h尿量(15.1±3.8m]);P＜0.05。结论:链脲佐菌素诱导大鼠I型糖尿病建模成功率高,重复性好,可做为糖尿病动物模型用于人类I型糖尿病的实验研究。第二部分体内实验胰岛-骨髓间充质干细胞联合移植治疗大鼠I型糖尿病目的SD大鼠胰岛细胞联合骨髓间充质干细胞门静脉移植治疗I型糖尿病大鼠,观察其疗效。方法32只STZ诱导的糖尿病SD大鼠随机分为组1(1000IEQ/只+1×10~6个BM-MSCs/只)、组2(500IEQ/只+1×10~6个BM-MSCs/只)、组3(1000IEQ/只)、组4(1×10~6个BM-MSCs/只),分离SD大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和胰岛,门静脉输注移植治疗四组大鼠。观察大鼠的血糖变化。结果1、门静脉穿刺输注方法一次穿刺成功率＞95%,术中出血＜0.5ml,手术成功率100%,围手术期死亡率为0%。2、组1、组2、组3大鼠术后血糖可稳定于16.7mmol/L以下的时间分别为(21.0±1.7天)、(15.2±1.3天)、(10.2±2.0天)。各组之间差异具有统计学意义,P＜0.05。组四大鼠血糖在术后12-14天时有一短暂向下波动,但始终未降至正常范围内。结论:1、门静脉穿刺输注移植胰岛与骨髓间充质干细胞法安全,操作时间短,大鼠并发症少,存活率高。2、胰岛联合BM-MSCS移植可降低大鼠血糖,与单独移植胰岛组相比,显著延长血糖降低时间。