Tim-3信号通路在小鼠实验性结肠炎中的作用

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背景与目的:炎症性肠病(IBD)的病因和发病机制目前尚不清楚,但已明确Th免疫反应和Toll样受体(TLR)信号通路异常在其中起着重要作用,并且这些异常在不同类型的IBD(UC和CD)中有所不同,但它们具体的调控机制迄今仍不是很明确。Tim-3信号通路是新发现的调节Th免疫反应的核心环节,并且与TLRs信号通路有密切关系。然而Tim-3信号通路在IBD发生发展中的作用,及它与IBD的Th免疫反应和TLRs信号通路变化的关系目前尚不清楚。为此,本研究在体内不同类型小鼠实验性结肠炎模型(分别类似人类的UC及CD的动物模型)中观察了Tim-3信号通路、TLRs信号通路和调节性T细胞(Treg)的变化,并以它为干预靶点,观察干预Tim-3信号通路对不同类型IBD的TLRs信号通路和Treg的影响,及其与疾病的的关系,从一新的角度探讨IBD的发病机制,为IBD的防治提供新的靶点和方向。方法:1.实验分组:分为下以几组:(1)Tim-3抗体未处理小鼠,(2)Tim-3抗体预处理小鼠;每组内再分别分为:①对照组,②DSS模型组,③TNBS模型组。2. IBD模型的建立:(1)DSS诱导小鼠炎症性肠病模型的建立:6~8周龄的BALB/C小鼠自由饮用5%DSS溶液7天,建立小鼠急性结肠炎模型。对照组只饮用清洁饮用水。(2)TNBS诱导小鼠炎症性肠病模型的建立:6~8周龄的BALB/C小鼠于禁食、不禁饮24小时后,乙醚麻醉,用3.5F导管从肛门插入肠道深约5.5cm,灌注TNBS/50%乙醇溶液100μ1,对照组灌注生理盐水100μ1,之后将小鼠倒置60秒。7天后处死小鼠。(3)小鼠Tim-3信号通路的干预:小鼠建模前12h腹腔内注射100μg抗-Fc抗体消除非特异性吸附,再给予100μg抗-Tim-3mAb腹腔注射,对照小鼠给予同等剂量的IgG1。3.各项指标的观察和检测:①观察各组小鼠每天体重、疾病活动指数DAI的变化;②肉眼观察小鼠结肠大体形态的改变,HE染色观察小鼠结肠病理组织学改变;③Western bolt方法检测小鼠结肠组织中Tim-3、Tim-1、Foxp3、MyD88、TLR4、SIGIRR蛋白的表达;④免疫组织化学染色检测小鼠结肠组织中Foxp3、MyD88、SIGIRR和NF-κBp65的表达。结果:(1)小鼠体重及DAI积分变化①无论是在Tim-3抗体未处理组还是处理组,对照组小鼠体重呈持续上升状态,模型组小鼠在造模后体重开始下降,在实验第5天各组体重均下降至最低点,随后逐渐回升。在实验第5、7天各模型组小鼠体重下降百分比均明显高于相应对照组(P<0.01),两模型组之间比较无差异(P>0.05)。Tim-3抗体预处理的各模型组体重下降百分比均低于未处理组,在第7天的TNBS组有统计学意义(P<0.05),其他组间差异均无统计学意义(P>0.05)。②各组小鼠DAI积分在实验第5、7天都有显著差异,无论是在Tim-3抗体未处理组还是处理组,各模型组显著高于相应对照组(P<0.01),不同模型组之间比较无差异(P>0.05);Tim-3抗体预处理的各模型组DAI积分均低于未处理组,在第7天的TNBS组有差异(P<0.05),其他组间差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)小鼠结肠病理学改变①小鼠结肠黏膜大体形态:无论是在Tim-3抗体未处理组还是处理组,对照组小鼠结肠黏膜未见充血、出血、水肿、糜烂、溃疡,DSS及TNBS组可见结肠黏膜有较明显充血、水肿、糜烂、溃疡;Tim-3抗体预处理的各模型组结肠黏膜充血、水肿和糜烂较未处理组稍有减轻。②HE染色观察各组小鼠的肠道病理组织学变化,无论是在Tim-3抗体未处理组还是处理组,DSS及TNBS组小鼠的结肠炎症程度、病变深度及隐窝破坏程度均高于相应对照组(P<0.05);不同模型组之间比较无差异(P>0.05)。Tim-3抗体预处理小鼠,无论是TNBS组还是DSS组,病理组织学损伤均显著低于未处理小鼠(P<0.01)。(3)小鼠结肠黏膜Tim-3蛋白表达无论Tim-3抗体处理与否,各组间小鼠肠黏膜Tim-3蛋白的表达无差异(P>0.05);Tim-3抗体预处理小鼠,各模型组Tim-3蛋白的表达高于未处理小鼠,但无统计学意义(P>0.05)。(4)小鼠结肠黏膜Tim-1蛋白表达在Tim-3抗体未处理组中,TNBS组高于对照组(P<0.05),其它两组间比较均无差异(P>0.05);在Tim-3抗体预处理组中,三组间比较均无差异(P>0.05);Tim-3抗体预处理各模型组Tim-1蛋白表达均低于未处理组,TNBS组间差异有统计学意义(P<0.05)。(5)小鼠结肠黏膜Foxp3表达①免疫印迹检测发现,无论Tim-3抗体处理与否,Foxp3蛋白在三组间的表达无差异(P>0.05);Tim-3抗体预处理的各模型组Foxp3蛋白表达均高于未处理组,但无统计学意义(P>0.05)。②免疫组化染色发现,无论Tim-3抗体处理与否,各组间小鼠结肠黏膜中Foxp3阳性炎细胞数有差异,两个模型组均低于相应对照组(P<0.05),且在Tim-3抗体处理组中TNBS组显著高于DSS组(P<0.01)。同时Tim-3抗体预处理的各模型组Foxp3阳性细胞数均高于未处理小鼠,TNBS组间差异有统计学意义(P<0.01)。(6)小鼠结肠黏膜SIGIRR表达①免疫印迹检测发现,无论Tim-3抗体处理与否,SIGRR蛋白表达在三组间表达无差异(P>0.05);Tim-3抗体预处理小鼠,各模型组SIGIRR蛋白表达均高于未处理小鼠,但都无统计学意义(P>0.05)。②免疫组化染色发现,Tim-3抗体未处理组中,小鼠结肠黏膜中SIGIRR表达有显著差异,各模型组显著低于对照组(P<0.01);在Tim-3抗体预处理组,各组之间差异无统计学意义(P>0.05)。同时Tim-3抗体预处理的各模型组SIGIRR表达均显著高于未处理组(P<0.05)。(7)小鼠结肠黏膜MyD88表达①免疫印迹检测发现,在Tim-3抗体未处理组中,三组间MyD88蛋白的表达有差异,TNBS组显著高于对照组和DSS组(P<0.01),DSS组高于对照组,但无统计学意义(P>0.05);在Tim-3抗体预处理组中,两个模型组都显著高于对照组(P<0.05),模型组间比较无差异(P>0.05);同时Tim-3抗体预处理组中的TNBS组MyD88表达低于未处理组(P<0.05)。②免疫组化染色发现,无论Tim-3抗体处理与否,小鼠结肠黏膜炎细胞中MyD88表达有显著差异,各模型高于对照组(P<0.05),模型组间比较无差异(P>0.05)。同时Tim-3抗体预处理的各模型组MyD88的表达均低于未处理组(P<0.05)。(8)小鼠结肠黏膜TLR4表达免疫印迹检测发现,TLR4蛋白在Tim-3抗体未处理组中的表达有差别,TNBS组显著高于DSS组及对照组(P<0.01),DSS组高于对照组,但无统计学意义(P>0.05);在Tim-3抗体预处理组,TLR4蛋白在组间的表达有差异,DSS组高于TNBS组及对照组组(P<0.05),TNBS组高于对照组,但无统计学意义(P>0.05)。同时Tim-3抗体预处理组中DSS组TLR4的表达高于未处理组(P<0.05)。(9)小鼠结肠黏膜NF-κBp65表达免疫组化染色发现,无论Tim-3抗体处理与否,小鼠结肠黏膜中NF-κB p65的表达有显著差异,各模型组显著高于对照组(P<0.01),各模型组间比较无统计学意义(P>0.05)。Tim-3抗体预处理的各模型组NF-κBp65表达低于未处理组(P<0.05)。结论:1.本研究成功的建立了DSS及TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎模型,Tim-3抗体预处理后小鼠结肠炎症减轻,提示了Tim-3抗体可以减弱小鼠实验性结肠炎的炎症反应。2. Tim-3抗体预处理后小鼠实验性结肠炎肠黏膜中Tim-3蛋白表达增加,而Tim-1蛋白表达降低,提示Tim-3及Tim-1可能参与了小鼠实验性结肠炎的发病机制。3. Tim-3抗体预处理后小鼠实验性结肠炎肠黏膜中Foxp3蛋白表达增加,提示了Tim-3抗体可能通过调控Treg细胞反应来影响小鼠结肠炎的发生。4. Tim-3抗体预处理后小鼠实验性结肠炎肠黏膜中MyD88、NF-κB p65蛋白表达下降,而TLRs信号通路的负性调控因子SIGIRR蛋白表达上升,提示Tim-3抗体可能通过增强TLRs/NF-κB信号通路的负性调控,抑制TLRs/NF-κB信号通路激活,从而影响小鼠实验性结肠炎的发生。
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