研究背景:视网膜色素上皮（Retinal pigmented epithelium,RPE）细胞是一层位于脉络膜毛细血管和视网膜感光细胞之间的多边形极性细胞,其离子转运、营养分泌、屏障作用以及吞噬代谢产物的功能对于维持视网膜感光细胞内外环境的稳定极其重要。包括糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性等致盲性眼病的发生都与RPE细胞的功能障碍有关,目前国内外对于此类疾病尚无明确有效的药物治疗手段。感光细胞和RPE细胞等终末分化细胞损伤后无法依靠自身再生修复,导致不可逆的视力丧失。近年来大量研究表明,干细胞替代疗法可有效缓解上述视网膜变性疾病的发展^[1,2]。目前研究人员利用胚胎干细胞（hESC-RPE）和多能干细胞（iPS-RPE）成功诱导出表型与成RPE相近的治疗细胞,并且通过大量的动物和临床实验中证实,干细胞来源的RPE细胞移植对于视网膜变性疾病有明确的短期疗效^[3,4],但研究发现这些治疗细胞在视网膜微环境中的长期生存并不理想,关键问题之一在于宿主对治疗细胞的免疫应答。研究表明:如果对受体的免疫应答不进行有效干预,绝大多数视网膜下腔的外源性RPE细胞在一定时间后都将发生免疫排斥反应^[5]。视网膜独特的屏障结构,加上视网膜固有细胞分泌的一系列免疫调节因子,使视网膜在正常情况下处于免疫豁免状态,相对稳定的免疫微环境是神经视网膜发挥功能的重要前提。但视网膜色素变性的发生与炎症和自身免疫反应关系密切,血视网膜屏障的破坏和小胶质细胞的激活进一步改变了视网膜的免疫微环境^[6,7]。此外,干细胞移植操作也可以损伤血视网膜屏障并引起炎症反应^[8,9]。受到以上因素综合影响,移植后的RPE治疗细胞处于复杂的免疫微环境中,这是影响其移植后长期疗效的不利条件。为克服受体视网膜对外源性RPE细胞的免疫排斥反应,在移植手术前后需要系统应用多种免疫抑制剂。而免疫抑制剂的使用不但效果有限,还可能损伤患者的肝肾功能并且引起机会感染^[10-12]。除此之外,干细胞临床转化研究人员正以各种方式探索获得可以逃避受体免疫攻击的“万能细胞”。目前已有科学家通过诱导PDL1和CTLA-4等抑制性配体在干细胞的表达,有效减少免疫细胞对治疗细胞的攻击^[13],据此我们提出以下问题:胚胎干细胞来源的色素上皮（hESC-RPE）细胞的免疫原性是否也有关键调控点?能否通过一定手段处理治疗细胞以减少免疫排斥反应?研究目的:通过研究视网膜色素变性免疫微环境的变化,寻找威胁hESC-RPE细胞治疗细胞移植后长期生存的关键因素,并据此探索调控hESC-RPE细胞免疫原性的重要信号通路,找到干预hESC-RPE细胞免疫原性的有效方法,以改善细胞生存、保护细胞功能,更好地实现干细胞治疗视网膜色素变性的临床转化。研究方法:本研究分为三个部分:第一部分:视网膜色素变性的免疫微环境研究按照RCS大鼠发育与视网膜色素变性不同阶段的关系,将RCS分为变性早期（出生后20天,P20d）变性中期（出生后40天,P40d）、和变性晚期（出生后60天,P60d）。利用大鼠细胞因子蛋白芯片研究变性晚期RCS大鼠视网膜免疫微环境的变化;利用RT-PCR技术对变性早、中、晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞相关细胞因子和趋化因子的mRNA表达水平进行评估。利用流式细胞术定量分析变性晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞的数量和激活状态并以免疫组织化学染色技术研究变性晚期RCS大鼠视网膜中淋巴细胞分布;通过ELISA技术定量分析变性不同阶段RCS大鼠视网膜匀浆中IFN-γ的浓度,研究视网膜中IFN-γ浓度与视网膜色素变性的关系。第二部分:hESC-RPE细胞的诱导分化与细胞免疫原性研究将hESCs诱导为hESC-RPE细胞,并通过细胞免疫荧光染色和流式细胞术鉴定色素上皮细胞特异性标记物在hESC-RPE细胞的表达情况;利用RT-PCR技术检测胚胎干细胞特征基因和色素上皮细胞特征基因在hESC-RPE细胞的mRNA表达情况;流式细胞术检测hESC细胞向hESC-RPE细胞分化后人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）的表达变化,以及细胞因子IFN-γ处理hESC-RPE细胞前后HLA抗原的表达变化,研究IFN-γ对hESC-RPE细胞免疫原性的影响。第三部分:Ruxolitinib对hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究利用RNA-Sequence（RNA-Seq）技术对IFN-γ和Ruxolitinib处理后hESC-RPE细胞中基因表达谱进行分析;在不同Ruxolitinib浓度阻断预处理后,再以IFN-γ刺激hESC-RPE细胞:流式细胞术检测药物作用下HLA-ABC、HLA-DR、HLA-E和HLA-G的表达水平变化,研究Ruxolitinib与hESC-RPE细胞HLA表达的量效关系,利用RT-PCR技术从mRNA水平证实Ruxolitinib对hESC-RPE细胞HLA相关基因表达的影响,并利用Western-Blot验证Ruxolitinib对hESC-RPE细胞免疫原性的调控机制。通过共培养实验评估Ruxolitinib预处理对hESC-RPE细胞免疫原性的调控:ELISA试剂盒检测hESC-RPE细胞与CD4⁺T淋巴细胞共培养后上清中IFN-γ的浓度,评估hESC-RPE细胞对CD4⁺T淋巴细胞的激活;LDH实验检测hESC-RPE细胞与CD8⁺T淋巴细胞和NK细胞共培养后上清中乳酸脱氢酶水平,评估hESC-RPE细胞对细胞毒性免疫细胞的激活;细胞免疫化学技术分析Ruxolitinib预处理后hESC-RPE细胞对CD8⁺T淋巴细胞和NK细胞趋化作用的变化。利用两种动物模型验证Ruxolitinib对免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用:用Ruxolitinib预处理后将Luc慢病毒标记的hESC-RPE细胞移植于人源化免疫系统小鼠皮下,IVIS Spectrum活体成像系统观察并记录移植后不同时间点细胞代谢荧光素底物后产生的生物发光信号,以评估Ruxolitinib对人免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用;将Ruxolitinib预处理的hESC-RPE细胞移植于RCS大鼠视网膜下腔,分别在移植后不同时间点利用fERG检测大鼠视网膜电生理功能,以间接评估移植后在RCS大鼠视网膜下腔hESC-RPE细胞的存活和功能。研究结果:第一部分:视网膜色素变性的免疫微环境研究1.出生后60天RCS大鼠视网膜中IL-2和IFN-γ等淋巴细胞相关细胞因子的浓度显著升高,提示变性晚期视网膜中可能存在淋巴细胞的浸润和激活。2.CCL2、CXCL9、CXCL10、CXCL11等趋化因子和IFN-γ、IL-2等细胞因子在RCS大鼠视网膜中mRNA表达水平显著高于相应天龄对照大鼠,且以上炎症因子在RCS大鼠视网膜中随天龄增加而表达上调。3.变性晚期RCS大鼠内层视网膜中有大量淋巴细胞的浸润,其中CD4⁺T淋巴细胞和NK细胞是视网膜中IFN-γ的重要来源。4.RCS大鼠视网膜中IFN-γ浓度随天龄增加而升高,且在出生后60天与对照大鼠视网膜中IFN-γ浓度形成统计学差异。第二部分:hESC-RPE细胞的诱导分化与细胞免疫原性研究1.分化诱导第70天的hESC-RPE细胞高表达色素上皮细胞特异性标记物Bestrophin、CRALBP、MITF和RPE65,其中Bestrophin主要表达于细胞膜,CRALBP主要表达于胞浆,RPE表达于细胞膜和胞浆,MITF主要表达于细胞核。2.在hESC向hESC-RPE细胞分化的过程中,干细胞特征性基因OCT4、Nanog和SOX2表达显著下调,而色素上皮细胞特征性基因表达显著上调。3.HLA-ABC、HLA-DR、HLA-E和HLA-G抗原在正常培养条件下hESC和hESC-RPE细胞的表达均较低;但在IFN-γ处理后,hESC-RPE细胞所有HLA抗原表达均显著上调。第三部分:Ruxolitinib对hESC-RPE细胞的免疫原性调控机制研究1.IFN-γ对hESC-RPE细胞的主要生物学效应为上调HLA抗原的表达,增强细胞抗原提呈作用、促进免疫排斥反应的发生。2.IFN-γ可通过提高hESC-RPE细胞STAT1蛋白表达和磷酸化水平诱导细胞HLA抗原表达,而一定浓度的Ruxolitinib预处理细胞可有效阻断IFN-γ的效应。3.IFN-γ对hESC-RPE细胞的紧密连接和吞噬功能都有损害,但一定浓度Ruxolitinib预处理可以保护细胞功能。4.IFN-γ可上调hESC-RPE细胞免疫原性,表现为hESC-RPE细胞对免疫细胞的趋化和激活,而Ruxolitinib预处理可降低hESC-RPE细胞的免疫原性。5.Ruxolitinib预处理可延长细胞在人源化免疫系统小鼠体内的存活时间;将Ruxolitinib预处理的hESC-RPE细胞移植于RCS大鼠视网膜下腔,在移植后早期（6周内）视网膜fERG检测结果与系统服用免疫抑制剂无显著差别,均能延缓RCS视网膜色素变性大鼠视功能的衰退。研究结论:1.视网膜色素变性改变了视网膜内相对免疫豁免的微环境,视网膜中淋巴细胞趋化因子和细胞因子表达水平逐渐升高,并在病变后期引起淋巴细胞的浸润和激活。淋巴细胞分泌的细胞因子IFN-γ在视网膜中浓度显著增加,表明细胞免疫的参与是其病变发生机制之一。2.胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞分化后,细胞免疫原性维持极低水平,但IFN-γ的刺激可显著提高hESC-RPE细胞免疫原性。IFN-γ对hESC-RPE细胞的主要生物学效应为上调HLA抗原的表达增强细胞抗原提呈作用、促进免疫排斥反应的发生。3.首次将JAK-STAT信号通路抑制剂Ruxolitinib应用于干细胞免疫原性研究,并且在hESC-RPE细胞上验证了Ruxolitinib调节细胞免疫原性的机制:通过阻断STAT1的蛋白表达和磷酸化抑制细胞在IFN-γ刺激下HLA抗原的上调,降低细胞的免疫原性,有效减少其对CD4⁺辅助性T淋巴细胞、CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的趋化和激活作用。4.创新性地运用人源化免疫系统小鼠模型,证明Ruxolitinib预处理对免疫微环境中hESC-RPE细胞的保护作用;并通过RCS大鼠视网膜下腔细胞移植实验证明Ruxolitinib可以改善hESC-RPE细胞在变性视网膜免疫微环境中的存活,更好地保护RCS大鼠视觉功能。