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研究目的：1.观察加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞增殖的影响。2.探讨加减驻景方含药血清对Akt转染后ARPE-19细胞培养上清液中VEGF含量的影响,并观察其对ARPE-19细胞Akt、mTOR和HIF-1a因子表达的影响,初步探讨加减驻景方抑制CNV形成的分子通路机制。研究方法：1.体外培养ARPE-19细胞,取生长良好的细胞用于实验,分为正常组、空白血清组、含药血清组、康柏西普组并设立不同干预浓度及观测时间。2.CCK-8法检测各组血清及药物对细胞活性的影响。3.将重组表达质粒pcDNA3.1-AKT以脂质体介导的方法转染ARPE-19细胞,建立Akt基因转染ARPE-19细胞模型。4.用免疫印迹法(Western Blot)检测验证模型细胞构建成功。5.体外培养ARPE-19模型细胞,取生长状态良好用于实验,分为正常组、模型组、模型细胞干预组(空白血清组、含药血清组、康柏西普组),并设立不同干预浓度及观测时间。6.CCK-8法检测各组对转染模型细胞活性的影响。7.用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组转染模型细胞上清中VEGF生长因子的表达。8.用实时定量PCR (RT-CR)法检测各组转染模型细胞中AKT、mTOR、 HIF-1a、VEGF基因(mRNA)的表达情况。9.用免疫印迹法(Western Blot)检测各组转染模型细胞中AKT、mTOR、 HIF-1a、VEGF蛋白表达的情况。研究结果：1.不同浓度的空白血清组、含药血清组培养ARPE-19细胞24h后,各组细胞活性与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05),对细胞生长无毒性；各组作用ARPE-19细胞48h及72h后血清高浓度组(20%、40%)细胞活性低于正常细胞组(P<0.05),而2.5%、5%、10%血清浓度对细胞活性影响不大(P>0.05)；康柏西普药物组各浓度作用细胞24h、48h、72h后,仅20μg/ml浓度与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05),对细胞活力影响不大,余40、80、160、320μg/ml的康柏西普组细胞活性小于正常组(P<0.05),对细胞活性有抑制作用。故后续试验中,血清浓度取2.5%、5%、10%,阳性对照康柏西普组浓度采取小于20μg/ml。2. Western Blot法检测构建的模型细胞中Akt蛋白表达显示：转染模型组中Akt蛋白的表达量较对照组明显增加,两组相对灰度值分析相比较,其差异有统计学意义(P<0.05),表明Akt基因转染模型构建成功,可用于后续实验。3.CCK-8法检测不同血清及药物对转染模型细胞活性的影响显示：各组培养24h、48h后,转染模型组OD值显著高于正常培养组(P<0.05)；5%、10%的含药血清组及10、20μg/ml康柏西普组OD值显著低于模型组(P<0.05),各浓度空白血清组与模型相比无统计学差异(P>0.05)；作用72h后,转染模型组OD值与正常培养组比较无统计学差异(P>0.05),说明可能随着作用时间延长,转染模型组细胞增殖能力降低,因此,后续试验时间取24h、48h进行检测观察,血清浓度为5、10%,康柏西普浓度为10、20μg/ml。4. ELISA法检测显示：空白血清组与模型组细胞上清液中VEGF表达量比较差异无统计学差异(P>0.05)；转染模型组细胞上清液中VEGF表达量显著高于正常细胞组(P<0.05),说明Akt在细胞中过表达可以促进VEGF的生成；干预组含药血清与康柏西普组细胞上清液中VEGF表达量均显著低于模型组(P<0.05),说明含药血清及康柏西普可抑制Akt过表达后VEGF的生成；5%含药血清组浓度与10%相比较,作用结果差异有统计学意义(P<0.05),康柏西普组20μg/ml浓度与10μg/ml相比较差异有统计学意义(P<0.05)。因此,取最佳浓度10%含药血清组、20ug/ml康柏西普组分别为治疗组和阳性对照组用于后续试验。5. RT-PCR法检测显示：正常培养24h和48h的转染模型组细胞Akt、mTor、 VEGF基因表达量显著高于正常细胞组(P<0.05),说明Akt转染ARPE-19细胞后,细胞中Akt、mTor、VEGF表达增加；空白血清组与转染模型组比较无统计学意义(P>0.05)；含药血清组、康柏西普组与转染模型组比较有统计学意义(P<0.05)；康柏西普组细胞中各因子含量小于含药血清组,差异有统计学意义(P<0.05),说明含药血清及康柏西普可抑制Akt过表达后细胞中Akt、mTor、VEGF mRNA的表达；正常培养24h和48h的转染模型组细胞中HIF-1α基因表达量和正常细胞组比较无明显差异(P>0.05),空白血清、含药血清及康柏西普组与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05),说明含药血清及康柏西普对AM过表达后细胞中HIF-1α mRNA的表达量无明显影响。6. Western Blot法检测显示：正常培养24h和48h的转染模型组细胞Akt、 mTor、VEGF蛋白表达量显著高于正常细胞组(P<0.05),说明Akt转染ARPE-19细胞后,细胞中Akt、mTor、VEGF蛋白表达增加；空白血清组与转染模型组比较无统计学意义(P>0.05)；含药血清组、康柏西普组与转染模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)；康柏西普组细胞中各因子含量小于含药血清组,差异有统计学意义(P<0.05),说明含药血清及康柏西普可抑制Akt过表达后细胞中Akt、mTor、VEGF蛋白的表达量；正常培养24h和48h的转染模型组细胞中HIF-1α蛋白表达量和正常细胞组比较无明显差异(P>0.05),空白血清、含药血清及康柏西普组与模型组比较没有显著性差异(P>0.05),说明含药血清及康柏西普对AM过表达后细胞中HIF-1α蛋白的表达量无明显影响。研究结论：1.AM基因转染后可诱导ARPE-19细胞的增殖,增加细胞中AKT、mTOR、 VEGF mRNA及蛋白的表达；2.加减驻景方含药血清对AM转染后ARPE-19细胞的增殖及AKl、mTOR、 VEGF mRNA及蛋白的表达有抑制作用；3.加减驻景方可能是通过抑制AKT的活化,调控AKT/mTOR/VEGF通路而抑制VEGF的表达,从而抑制或延缓CNV的形成。