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目的：本实验通过检测肝癌外周血中循环肿瘤细胞中上皮间质转化(EMT)标志物Twist,Vimentin的表达，同时运用Western blot和免疫组化方法检测EMT标志物E-cadherin, Vimentin在原发性肝癌组织中表达，分析其表达水平与门静脉癌栓等临床病理参数的相关性，探讨循环肿瘤细胞上EMT标志物的表达水平可作为肝癌转移早期诊断的有效指标的临床意义，同时对循环肿瘤细胞在外周血中形成机制研究做初步的探索。方法：收集第三军医大学新桥医院肝胆外科2011年11月至2012年11月不同分期肝癌患者外周血标本共40例，收集原发性肝癌患者术中肝癌组织及相邻正常组织标本各30例。采用免疫磁珠分选外周血中循环肿瘤细胞，免疫荧光鉴定循环肿瘤细胞及EMT标志物的表达，Western blot荧光发光定量检测Vimentin, E-cadherin在肝癌组织及相邻正常组织表达，免疫组化化学法检测E-cadherin, Vimentin,Twist在肝癌组织及相邻正常组织表达分布。所有数据采用SPSS13.0软件作统计分析，数据统计采用Fisher’s确切概率法，配对t检验，Mann-Whitney U检验，spearman等级相关分析，数据采用均数±标准差(x±s)表示，以P <0.05为差异有统计学意义。结果：1.从40例肝癌患者外周血中成功分选出循环肿瘤细胞31例，其分选阳性率达77.5%(31/40)。免疫荧光鉴定可发现循环肿瘤细胞具有更大的细胞直径，完整的核仁，较高的核浆比率，同时可有CTCs染色HSA和DAPI阳性, CD45染色阴性。作为对照组中的良性肝病患者、非肝癌肿瘤患者、健康自愿者均未检出CTCs。2.循环肿瘤细胞分选的阳性率在门静脉癌栓的患者中(95.0%)较无门静脉癌栓的患者(60.0%)明显增高(P=0.02)；CTCs分选的阳性率在Edmondson-Steiner病理分级III or IV(91.7%)较病理分级I or II (37.5%; P=0.018)明显增高；CTCs分选的阳性率在超过Milan标准的患者中为(92.9%)，较符合Milan标准的患者(41.7%; P=0.001)显著增高；CTCs分选的阳性率与肿瘤大小呈明显的正相关(r=0.472, P=0.002)；CTCs分选的阳性率与肿瘤的TNM分期有明显的相关性(r=0.564, P <0.001)；然而CTCs分选的阳性率与年龄、性别、病因、肝硬化、肿瘤数量、肝功能分级和AFP水平无明显相关性，差异无统计学意义。3.在31例循环肿瘤细胞分选阳性的患者中Twist在CTCs上的表达率为83.8%(26/31)，CTCs中Twist的阳性表达率在门静脉癌栓形成患者中(100.0%)明显高于无门静脉癌栓患者(58.3%; P=0.005)，然而Twist在CTCs中的表达率与其他临床病理参数无明显相关性。在31例CTCs分选阳性的患者中Vimentin在CTCs上的表达率为80.6%(25/31)，CTCs中Vimentin的阳性表达率与门静脉癌栓(P=0.022)、Edmondson-Steiner病理分级(P=0.014)、Milan标准(P=0.038)、肿瘤大小(r=0.643, P <0.001)、肿瘤TNM分期(r=0.488, P=0.005)有明显的相关性。Twist与Vimentin在CTCs上共表达的阳性率为70.9%(22/31)，其共表达阳性率与门静脉癌栓(P <0.001)、肿瘤大小(r=0.436, P=0.014)、肿瘤TNM分期(r=0.382, P=0.034)有明显的相关性，而与其他临床病理参数相比较无统计学差异。4. E-cadherin在肝癌组织中表达的相对定量值为0.082±0.063，较相邻正常组织表达量0.226±0.215显著降低(t=-4.050，P <0.001)；E-cadherin在有门静脉癌栓患者的肝癌组织中表达量为0.042±0.032，较无门脉癌栓患者癌组织中表达量0.116±0.063明显降低(U=34.0，P=0.001)；E-cadherin在肝癌TNM Ⅲ期患者癌组织表达量为0.048±0.034，较肝癌TNMⅠ∕Ⅱ期患者癌组织中表达量0.121±0.067明显降低(U=41.0，P=0.003)；E-cadherin在肝癌组织中的表达与肿瘤病理分级无明显相关性(U=99.0，P=0.719)。5. Vimentin在肝癌组织组织中表达的相对定量值为0.638±0.397，较相邻正常组织表达量0.398±0.282明显增高(t=3.393，P=0.002)；Vimentin在所有肝癌组织中的表达与E-cadherin在肝癌组织中的表达呈明显的负相关(r=-0.509，P=0.004)；Vimentin在有门静脉癌栓形成患者肝癌组织中表达量为0.913±0.363，较无门静脉癌栓患者癌组织表达量0.397±0.239显著增高(U=24.0，P <0.001)。Vimentin在肝癌TNM Ⅲ期患者癌组织表达量为0.870±0.359，较TNM Ⅰ∕Ⅱ期患者表达量0.372±0.245显著增高(U=25.0，P <0.001),而Vimentin在肝癌组织中的表达量与其他临床病理参数比较无明显统计学差异。6.免疫组化检测肝癌组织及相邻正常组织镜下可见E-cadherin在肝癌组织中表达微弱，而相邻正常组织中呈高表达，其表达主要位于细胞膜；Vimentin在肝癌组织中呈明显高表达，呈棕黄色颗粒状位于细胞质内，而在相邻正常组织中不表达；Twist在肝癌组织中高表达，呈深棕色颗粒位于细胞核和细胞质内，而在相邻正常组织内不表达。结论：1.在不同分期的原发性肝癌患者中，循环肿瘤细胞分选的阳性率与门静脉癌栓、肿瘤病理分级、Milan标准、肿瘤大小和肿瘤TNM分期有明显的相关性,表明CTCs分选的阳性率可作为预测肝癌预后发展的有效指标。2.表达于循环肿瘤细胞上的Twist、Viementin的水平与一系列临床病理参数相关，但Twist在CTCs阳性表达率、Vimentin在CTCs阳性表达率及Twist和Vimentin在CTCs共表达阳性率与患者门静脉癌栓显著相关，说明Twist与Vimentin在CTCs上的表达水平可作为潜在的预测肝癌转移的早期诊断工具。3. E-cadherin与Vimentin在原发性肝癌癌组织中表达呈明显的负相关，表明在原发性肝癌中发生了EMT。且随着肿瘤不断进展，EMT发生愈发明显，与此同时，CTCs分选的阳性率逐渐升高，Twist与Vimentin在CTCs中的表达水平逐渐增高，这表明EMT可能在促进CTCs形成过程中发挥重要作用，这为CTCs形成机制研究及肝癌转移的靶向治疗提供新的思路。