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第一部分人eNOS基因重组腺病毒载体的构建与鉴定目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建人内皮型一氧化氮合成酶基因（heNOS）和.-半乳糖苷酶基因（LacZ）重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒方法：利用聚合酶链反应（PCR）扩增出heNOS全长基因，插入PSUCMV中构建成腺病毒穿梭质粒PSUCMV-heNOS，转化大肠杆菌感受态DH5.，挑取阳性菌株，酶切鉴定正确后，DNA测序，结果与基因数据库中人内皮型一氧化氮合成酶cDNA序列一致；与5型腺病毒骨架质粒PBHGE3共转染293细胞包装病毒颗粒，得到含有携带heNOS的复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMV-heNOS）的病毒上清，纯化病毒，用TCID50方法测病毒滴度。结果：成功构建人eNOS重组腺病毒载体和LacZ重组腺病毒载体，病毒滴度达3.5X1010PFU／ml和3.0X1010PFU／ml，通过PCR鉴定正确。结论：heNOS重组腺病毒的构建为血管内膜增生等疾病的基因治疗提供可能。第二部分腺病毒介导的人eNOS基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖及其机制的研究目的：观察腺病毒介导的人eNOS基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞增殖的作用，探讨人eNOS基因转染对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKI）p21、p27表达的变化及细胞周期、凋亡的影响。方法：原代培养人脐带动脉平滑肌细胞并纯化鉴定，以不同的感染复数（MOI）的heNOS重组腺病毒转染血管平滑肌细胞，噻唑蓝比色法测定吸光度值（OD570），绘制细胞生长曲线。同时LacZ重组腺病毒转染和未转染的血管平滑肌细胞为对照组。NADPH染色、细胞免疫组化、RT-PCR、western blot检测血管平滑滑肌细胞中的人eNOS基因的表达。放射免疫法检测血管平滑肌细胞中的cGMP的表达变化；western blot检测血管平滑肌细胞中p21、p27蛋白的变化，流式细胞术分析对细胞周期分布及凋亡的影响。结果：随着MOI值的增大，吸光度值逐渐降低，转染120h以后MIO为300组与MOI为100、150、200组及空白对照组比较显著抑制血管平滑肌细胞的增殖（p＜0.01）。以MOI为300转染血管平滑肌细胞48h，NADPH染色、细胞免疫组化、RT-PCR、western blot均证实有人eNOS基因的表达，对照组无表达。放射免疫法检测heNOS转染组cGMP含量明显高于LacZ组和未转染组，有显著差异（p＜0.01）。western blot证实heNOS转染组的p21、p27蛋白表达明显上调（p＜0.05）。细胞流式检测heNOS转染组G0／G1期细胞平均百分数与对照组比较明增加（p＜0.05）。转染24h和72h后三组无明显细胞凋亡（p＞0.05）。结论：人eNOS基因转染血管平滑肌细胞抑制细胞增殖，通过p21、p27上调导致细胞周期的阻滞，无诱导细胞凋亡。第三部分腺病毒介导的人eNOS基因转染抑制大鼠颈动脉损伤后新内膜形成目的：探讨腺病毒介导的人eNOS基因局部转染对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法：SD大鼠球囊损伤颈动脉后，分别局部转染滴度为3.0×1010pfu／mlLacZ重组腺病毒（n=8）和3.5×1010pfu／ml heNOS重组腺病毒（n=8）100ul，转染30分钟，同时设单纯损伤为对照组。于4、7、14、21天后切取损伤动脉，免疫组化法、western blot检测转染损伤动脉壁中层heNOS的表达。苏木精-伊红染色观察损伤动脉的内膜和中膜的增生情况，单盲法计算机分析内膜和中膜的面积及其比值，判断内膜增生程度。结果：成功建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，免疫组化、western blot证实heNOS基因在转染损伤的动脉壁中层有效的表达。颈动脉损伤7天后内膜开始增生，14天后进一步加重，血管平滑肌细胞迁移和增殖，基质细胞增多，21天后内膜增生严重，管腔狭窄明显而heNOS转染内膜增生不明显。形态学分析显示损伤14、21天后heNOS组内膜面积、内膜面积／中膜面积（I／M）明显低于损伤组和LacZ转染组（p＜0.05）。而LacZ组和损伤组之间差别不明显（p＞0.05）。结论：腺病毒介导的人eNOS基因局部转染大鼠球囊损伤的颈动脉抑制新内膜的形成，可减少球囊血管成型术后管腔再狭窄。