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目的:1.探究“化痰祛瘀方”对喉鳞癌Hep-2、TU212细胞增殖复制、细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移和侵袭的细胞行为学影响。2.探究“化痰祛瘀方”对喉鳞癌Hep-2、TU212细胞内信号转导和转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)及受STAT3调控下游因子的影响,进一步阐释目的1中作用机制。3.建立痰凝血瘀证喉鳞癌移植瘤裸小鼠模型,从动物个体水平探究“化痰祛瘀方”对痰凝血瘀证喉鳞癌细胞增殖的影响。4.探究“化痰祛瘀方”对痰凝血瘀证喉鳞癌STAT3及受STAT3调控下游因子的影响,进一步验证体外实验作用机制。方法:1.采用CCK8法检测“化痰祛瘀方”干预喉鳞癌Hep-2、TU212细胞IC50,筛选最佳干预药物浓度和干预时间。2.运用倒置显微镜观察不同浓度“化痰祛瘀方”对喉鳞癌Hep-2和TU212细胞形态的影响。3.通过CCK8法检测“化痰祛瘀方”对喉鳞癌Hep-2和TU212细胞增殖活性的影响。4.使用PI流式细胞术检测不同浓度“化痰祛瘀方”对喉鳞癌Hep-2和TU212细胞周期的影响。5.采用荧光显微镜观察不同浓度“化痰祛瘀方”干预和Edu染色后Hep-2和TU212细胞DNA复制变化。6.运用Annexin-V-FITC流式细胞术检测不同浓度“化痰祛瘀方”对喉鳞癌Hep-2和TU212细胞凋亡的影响。7.通过荧光显微镜观察不同浓度“化痰祛瘀方”干预且经Hochest33342染色标记后喉鳞癌Hep-2和TU212细胞凋亡变化。8.运用倒置显微镜观察和记录不同浓度“化痰祛瘀方”干预喉鳞癌Hep-2和TU212细胞后细胞迁移能力变化。9.通过正置显微镜观察和记录不同浓度“化痰祛瘀方”干预后喉鳞癌Hep-2和TU212细胞对基质胶包被的Transwell小室侵袭能力变化。10.采用不同浓度“化痰祛瘀方”干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞48h,Western Blot检测药物干预后细胞内STAT3、磷酸化信号转导和转录活化因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)、细胞周期因子D1(Cyclin D1)、细胞周期因子B1(Cyclin B1)、P27、Bcl-2、Bax、Caspase-3、E-cadherin及基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP9)蛋白表达。11.采用“病证结合”方式建立动物模型:通过高脂高胆固醇饲料喂养+0.1%盐酸肾上腺素腹部皮下注射+冰水游泳刺激,建立痰凝血瘀证裸小鼠模型,再皮下注射Hep-2喉鳞癌细胞,成为痰凝血瘀证喉鳞癌移植瘤裸小鼠。12.瘤体体积均匀的痰凝血瘀证喉鳞癌移植瘤裸小鼠随机分为对照组(Con)、“化痰祛瘀方”低剂量组(Low)、“化痰祛瘀方”中剂量组(Mid)、“化痰祛瘀方”高剂量组(Hi)和顺铂组(Cis)共5组,6只/组。其中Con组给予生理盐水0.2m L灌胃,1次/日,共3周;Low、Mid及Hi三组给予“化痰祛瘀方”中药灌胃,1次/日,干预3周;Cis组顺铂腹腔注射给药,1次/周,共3次。给药期间记录各组裸小鼠一般状态和体征、饮水进食量和体重变化,测量各组裸小鼠瘤体体积变化。13.药物干预结束后,麻醉处死各组裸小鼠,摘取喉鳞癌移植瘤,RT-PCR检测各组喉瘤组织内STAT3、Bcl-2、Bax、P27、Cyclin D1和Cyclin B1 m RNA表达;Western Blot检测STAT3、P27、Cyclin D1和Cyclin B1蛋白表。结果:1.结合IC50结果,采用0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”干预喉癌Hep-2及TU212细胞48h后,随着药物浓度的上升,两株细胞数量逐渐减少、密度下降,细胞增殖减缓,细胞发生皱缩、体积变小。2.“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞12h、24h、48h后,两株细胞增殖均受到抑制(P<0.05),且呈现浓度-时间依赖效应。3.0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞48h后,两株细胞G0/G1期细胞比例增加(P<0.05),S期细胞比例下降(P<0.05),G2/M期细胞比例下降(P<0.05),两株细胞细胞周期均被抑制在G0/G1期。4.0、0.8、1.6mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞48h后,两株细胞中处于DNA复制阶段细胞比例下降(P<0.05)。5.0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞48h后,凋亡细胞比例均随着药物浓度增加而增加(P<0.05)。6.0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞48h后,两株细胞细胞核浓缩而染色呈亮蓝色,或核呈分叶、碎片状边集,或可见凋亡小体,且比例随着干预药物浓度的升高而增多。7.0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞后,细胞迁移运动能力均受到抑制,抑制作用随着药物浓度升高而增大(P<0.05)。8.0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞48h后,穿过基质胶包被的Transwell小室细胞数量随着干预药物浓度的增加而减少。9.0、0.8、1.6和3.2mg/m L“化痰祛瘀方”分别干预喉鳞癌Hep-2及TU212细胞后,细胞内STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、Cyclin B1、Bcl-2和MMP-9蛋白表达下调,且下调程度随着药物浓度增加而增加(P<0.05);化痰祛瘀方”上调P27、Bax、Caspase-3和E-cadherin蛋白表达,且调控程度随着药物浓度增加而增加(P<0.05)。10.痰凝血瘀证造模前,造模对照组和造模组裸小鼠体重、饮水及进食量比较未见明显差异(P>0.05);造模后,两组裸小鼠体重、饮水及进食量比较同样未见明显差异(P>0.05)。造模后两组裸小鼠血脂功能有所差异,其中造模组总胆固醇高于造模对照组(P<0.05);造模对照组高密度脂蛋白高于造模组(P<0.05),而两组凝血功能比较未见明显差异(P>0.05)。11.药物干预后痰凝血瘀证喉鳞癌移植瘤生长速度受到抑制,与Con组比较,Hi组及Cis组有明显抑制作用(P<0.05)。12.Con组、Low组、Mid组、Hi组和Cis组喉鳞癌瘤体组织中STAT3、Bcl-2、Cyclin D1、Bax m RNA表达下调(P<0.05),P27 m RNA表达上调(P<0.05),而Cyclin B1 m RNA表达无明显变化(P>0.05)。13.与Con组比较,Low组、Mid组、Hi组和Cis组裸小鼠瘤体组织中STAT3、Cyclin D1和Cyclin B1蛋白表达均下降(P<0.05),而Low组、Mid组、Hi组P27蛋白表达上调(P<0.05)。结论:1.“化痰祛瘀方”以浓度依赖性抑制喉鳞癌Hep-2及TU212细胞增殖和DNA复制,期机制之一可能是通过抑制STAT3信号通路发挥作用。2.“化痰祛瘀方”以浓度依赖性将喉鳞癌Hep-2及TU212细胞周期抑制在G0/G1期,可能机制之一是通过下调STAT3信号通路下游因子Cyclin D1、Cyclin B1表达和上调P27表达实现。3.“化痰祛瘀方”可能通过浓度依赖性下调喉鳞癌Hep-2及TU212细胞STAT3信号通路下游因子Bcl-2表达但上调Bax和Caspase-3表达发挥诱导细胞凋亡作用。4.“化痰祛瘀方”以浓度依赖性抑制喉鳞癌Hep-2及TU212细胞迁移和侵袭,其机制之一可能是通过上调STAT3信号通路下游因子E-cadherin、下调MMP-9表达而发挥作用。5.体内实验证实“化痰祛瘀方”通过下调STAT3及其下游因子Cyclin D1和Cyclin B1表达而上调P27表达发挥抑制喉鳞癌增殖作用。