研究目的:金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,简称金葡菌,是临床重要的病原体之一。中国抗菌药物监测网的最新数据（2021年）显示:在301917株临床分离菌株中,金葡菌占比8.93%,排名第三。金葡菌在机体免疫力降低时可诱发严重的感染性疾病,主要包括皮肤及软组织感染（skin and soft-tissue infections,SSTIs）、肺炎、心内膜炎、烧伤及战伤感染、败血症、中毒性休克等。金葡菌是SSTIs最主要的病原体,据统计,金葡菌引发成年人SSTIs的比率大于30%,引发儿童SSTIs的比率大于80%。除了上述感染性疾病外,金葡菌的定植还与慢性炎症性疾病的发生发展有关。大约20%的人群永久性定植金葡菌但并无明显的感染症状,其定植部位主要包括鼻腔、皮肤、咽部以及胃肠道等。相比于健康人群,糖尿病、特应性皮疹、银屑病、慢性阻塞性肺疾病和慢性肾炎等慢性炎症性疾病患者体内金葡菌定植的比例显著升高。已有的研究表明,在银屑病和特应性皮炎等慢性炎性皮肤病患者群体中,金葡菌的定植率超过50%。β-溶血素,简称Hlb蛋白,是一种金葡菌外毒素,具有中性鞘磷脂酶活性和结合核酸的活性。传统认为Hlb蛋白在金葡菌感染过程中几乎不发挥作用是由于大部分临床分离的金葡菌不表达Hlb蛋白。金葡菌不表达Hlb蛋白是由于hlb基因内部插入了噬菌体φSa3的基因片段,hlb基因被截断导致蛋白无法表达。然而,越来越多的证据表明,在金葡菌感染过程中,面对宿主免疫清除和抗生素杀伤的压力,φSa3的基因片段会被精准剪切,Hlb蛋白得以恢复表达。这提示我们Hlb蛋白可能在金葡菌的体内存活和疾病进展中发挥重要的作用。流行病学调查发现:在SSTIs患者分离的金葡菌菌株中,Hlb蛋白表达率超过40%;在特应性皮炎患者分离的金葡菌菌株中,Hlb蛋白表达率超过50%。在皮肤感染处分离的金葡菌菌株中Hlb蛋白的表达率较高,表明Hlb蛋白可能参与了金葡菌诱发的皮肤感染。本研究旨在探索Hlb蛋白是否参与了金葡菌的皮肤感染以及相关的分子机制,为预防和治疗金葡菌皮肤感染提供候选药物靶点和新的干预策略。研究方法:利用大肠杆菌表达体系,重组表达了Hlb蛋白,纯化后的Hlb蛋白经去内毒素树脂去除内毒素,随后经过细菌过滤器过滤除菌,进而通过皮下注射Hlb蛋白的方式构建小鼠皮肤炎症模型;通过人磷酸化RTK检测试剂盒（Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit,RD）筛选Hlb蛋白处理后磷酸化的膜受体;利用特异性抗体通过Western Blot验证表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）磷酸化水平的变化;利用HE（hematoxylin-eosin staining）染色监测小鼠皮肤组织病理改变;利用免疫组织化学技术（immunocytochemistry,IHC）检测募集的炎性细胞类型;利用ELISA和GST-pull down检测Hlb蛋白与EGFR的结合;利用ELISA检测IL-8的分泌;利用流式细胞术检测CD107a的表达;利用ELISA检测IFN-γ的表达;利用RT-PCR检测NK-92细胞FOSB和JUN m RNA水平的变化。通过计算机虚拟筛选获得了能够与Hlb结合的候选化合物,并进一步通过溶血实验筛选能阻断Hlb蛋白溶血的化合物。研究结果（包括以下六个部分的研究内容）:第一,成功构建了Hlb蛋白诱发的小鼠皮肤炎症模型。皮下注射Hlb蛋白部位出现了红肿、脱毛、和溃烂等症状,组织HE染色显示,注射Hlb蛋白部位皮肤的表皮层和真皮层均增厚且有大量炎性细胞的浸润。第二,尽管Hlb蛋白是一种溶血素,但即使在“热-冷”（“hot-cold”）条件下,大多数宿主细胞并不能被Hlb蛋白裂解,而且“热-冷”条件在生理状态下并不存在。随后我们证实了人表皮细胞系细胞Ha Ca T不能被Hlb蛋白直接杀伤,表明Hlb蛋白通过非细胞裂解作用诱发了皮肤炎症。受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase-RTK）是一类具有重要调控功能的酶联受体,其定位于细胞膜,能够同配体结合继而自身磷酸化并激活下游信号通路。RTK的细胞表面丰度和活化水平的改变与炎症、糖尿病、心血管疾病以及肿瘤等多种疾病密切相关。通过检测Ha Ca T（人表皮细胞）和HFF-1（人皮肤成纤维细胞）细胞膜表面多种RTK的磷酸化水平,我们发现Hlb蛋白可以特异性促进EGFR的磷酸化。进一步在细胞水平和小鼠体内证实了Hlb蛋白可以促进EGFR的磷酸化,而且EGFR抑制剂erlotinib可以阻断这一促进作用。在小鼠体内,利用erlotinib阻断EGFR的激活后,Hlb蛋白诱导的小鼠皮肤炎症明显减轻。表明EGFR的异常激活参与了Hlb蛋白诱发的皮肤炎症。第三,为了进一步研究Hlb蛋白促进EGFR活化的分子机制,表达纯化了Hlb H-288-N、HlbH-149-N和HlbH-161-A突变体蛋白。HlbH-288-N和HlbH-149-N蛋白不具有鞘磷脂酶活性,HlbH-161-A蛋白不具备结合核酸的活性。在这3个突变体蛋白中,鞘磷脂酶活性缺失的Hlb突变体蛋白(HlbH-288-N和HlbH-149-N)不能激活EGFR。此外,在Ha Ca T和A549细胞培养体系中加入鞘磷脂,可以阻断Hlb蛋白激活EGFR。Hlb蛋白通过鞘磷脂酶活性可以将鞘磷脂分解为神经酰胺和磷酸胆碱。在Hlb蛋白与A549细胞孵育后的细胞上清中检测到了磷酸胆碱,表明在现有的培养体系中Hlb蛋白降解了细胞膜上的鞘磷脂。然而外源性细胞膜透过性神经酰胺（C2、C6神经酰胺）和磷酸胆碱均不能激活EGFR,表明Hlb蛋白激活EGFR不依赖于其降解鞘磷脂的产物。EGFR通常是由其特异性配体激活,目前发现的EGFR配体有7种:表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）,转化生长因子α（transforming growth factorα,TGFα）,双调蛋白（amphiregulin,AR）,表皮调节素（epiregulin,EPR）,肝素结合EGF样生长因子（heparin binding EGF-like growth factor,HB-EGF）,epigen（EPN）和betacellulin（BTC）。所有EGFR配体均以I型跨膜蛋白的形式表达,主要通过去整合素和金属蛋白酶（A disintegrin and metalloproteases,ADAM）水解为可溶性的成熟体。尽管我们利用不同的特异性抗体没有检测到Ha Ca T细胞表达这7种内源性配体,但是广谱的金属蛋白酶抑制剂和ADAM17抑制剂部分阻断了Hlb蛋白介导的EGFR的磷酸化,表明Hlb蛋白可能促进了ADAM对配体的切割。进一步的研究结果表明Hlb蛋白可以与EGFR直接结合,并且Hlb蛋白可以促进细胞膜蛋白中EGFR的磷酸化,提示Hlb蛋白有可能作为EGFR的外源性配体直接激活EGFR。第四,将Hlb、HlbH-288-N和HlbH-161-A突变体蛋白分别经皮下注射入BALB/c小鼠皮肤,发现鞘磷脂酶活性缺失的HlbH-288-N蛋白不能诱发小鼠皮肤炎症。进一步的实验结果发现,Hlb蛋白在C57BL/6N小鼠和BALB/c Nude小鼠体内均可以诱发皮肤炎症。BALB/c Nude小鼠是T淋巴细胞缺陷小鼠,但在Hlb蛋白注射部位同样有大量炎性细胞的浸润,表明T细胞可能不参与Hlb蛋白诱发的皮肤炎症。进一步利用anti-CD11b（靶向单核巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞）、anti-Ly6G（靶向中性粒细胞）和anti-NKp46（靶向自然杀伤细胞）检测炎性部位的细胞种类,发现皮肤炎症部位的细胞主要为CD11b+细胞和NK细胞,在炎症反应早期有少量中性粒细胞。EGFR活化后会上调趋化因子IL-8的分泌,我们检测到Hlb蛋白上调Ha Ca T细胞IL-8的分泌,表明Hlb蛋白可能通过促进趋化因子的分泌募集了炎性细胞。第五,由于在Hlb蛋白诱导的小鼠皮肤炎症组织中检测到NK细胞的浸润,结合我们前期的发现Hlb蛋白诱导CD56brightNK细胞分泌IFN-γ,于是进一步研究了Hlb蛋白对NK细胞的活化作用。我们发现Hlb蛋白可以促进NK-92细胞和原代NK细胞CD107a的表达,促进NK-92细胞对K562细胞的杀伤,这表明Hlb蛋白诱导了NK细胞的活化。进一步的研究表明其机制可能包括两个方面:一方面,Hlb蛋白可能通过激活JNK上调了Fos B和Jun的表达,Fos B和Jun是转录因子AP-1的两个亚基,可以二聚化为AP-1,进而上调了IFN-γ的表达;另一方面Hlb蛋白可能通过钙离子信号促进了CD107a由溶酶体转运至细胞膜表面,促进NK细胞对靶细胞的杀伤。第六,Hlb蛋白在金葡菌引发的皮肤感染过程中发挥了重要的作用,因此其有可能成为预防和治疗金葡菌皮肤感染的候选药物靶点。我们初步筛选了59个能够与Hlb结合的候选化合物,并进一步从中筛选出2个能阻断Hlb蛋白溶血活性的化合物。研究结论:金葡菌Hlb蛋白能够诱发小鼠皮肤炎症,其机制可能为:Hlb蛋白通过两种方式导致皮肤组织细胞中EGFR及其下游信号通路的异常活化,进而上调趋化因子的分泌,趋化因子募集了炎性细胞进而诱发小鼠皮肤炎症。本研究丰富了Hlb蛋白与宿主相互作用的分子机制,为预防和治疗金葡菌诱发的皮肤感染提供候选药物靶点和新的干预策略。