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目的:环境中电离辐射对人体细胞基因组DNA造成最严重的一种损害是DNA双链断裂(DNA double strand breaks,DSBs),当发生DSBs时,人体细胞最主要的修复通路是以DNA-PKcs蛋白(DNA-dependent Protein Kinase Catalytic Subunit)为核心因子主导的DNA非同源性末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)。近年来,对DNA-PKcs进行了大量研究,DNA-PKcs作为上游的关键蛋白激酶在NHEJ通路中发挥重要的作用。因此,我们关注电离辐射致人体细胞基因双链断裂损伤后DNA-PKcs蛋白激酶活性的变化,研究其激酶活性增强具有辐射时间剂量效应,从而可以作为人体细胞基因放射损伤修复机制研究的靶蛋白。随着近年来不断有研究表明DNA-PKcs蛋白可以通过结合RNA发挥功能,我们进一步从RNA-蛋白复合体角度研究DNA-PKcs蛋白在电离辐射损伤修复过程中的作用。方法:(1)在室温条件下使用本院60 Coγ射线照射构建细胞DSBs模型。8Gy剂量照射U2OS细胞,分别收取未照射对照组(con)和照后(0.5、1、2、4、8 h)时间点的细胞,通过Western Blots实验观察电离辐射后不同时间点DNA-PKcs蛋白及其Ser2056位点磷酸化表达情况;接下来对U2OS细胞进行不同剂量(0,2,4,8 Gy)60Coγ射线照射处理,收取2h时间点细胞,Western Blots实验观察DNA-PKcs蛋白及其Ser2056位点磷酸化表达情况。同时为了排除细胞特异性实验采用不同剂量(0,2,4,8 Gy)的60Coγ射线照射HeLa细胞、293T细胞、HepG2细胞,Western Blots实验观察照射后2h时间点各细胞中DNA-PKcs蛋白Ser2056位点磷酸化表达情况。(2)以DNA-PKcs为目标蛋白,实验用8Gy 60Coγ射线照射U2OS细胞,分别提取未照射对照组(con)和照射后(0.5、1、2、4、8 h)各个时间点样品核蛋白,对其分别进行特异性RNA结合蛋白免疫沉淀,分离提取沉淀中蛋白质和RNA,Western Blots实验验证抗体蛋白富集效果,利用RNA分光光度仪和电泳实验对免疫沉淀复合物中分离纯化的RNA质量进行初步检验;高通量测序分析(诺禾致源公司)实验备选RNA样品,对于测序数据结果,使用Fast QC进行质量控制与统计,通过BWA软件与参考基因进行比对,使用cufflink软件拼接比对结果并计算表达量。通过差异分析将对照组(con)分别和实验照射组(0.5h、1h)差异表达基因的交集作为研究与DNA-PKcs蛋白结合RNA的目标基因组。然后对目标基因组进行功能注释(GO注释和KEGG注释),筛选出富集度较高的RNA分子作为后续研究的候选RNA并进行qRT-PCR实验表达验证,选出差异大的RNA作为最后研究对象。使用siRNA抑制目标RNA表达的方法进行功能实验,同时选用敲低DNA-PKcs表达和使用DNA-PKcs激酶活性抑制剂的实验组进行结果对照。结果:(1)60Coγ射线照射后DNA-PKcs蛋白激酶活性增强具有时间效应。(2)60Coγ射线照射后DNA-PKcs蛋白激酶活性增强具有剂量效应。(3)60Coγ射线照射对DNA-PKcs蛋白激酶活性的剂量效应不具有细胞特异性。(4)实验所选DNA-PKcs抗体能够有效的免疫沉淀DNA-PKcs蛋白。(5)实验分离纯化获得的RNA分光光度计测得OD260/280范围在1.8-2.2,凝胶电泳质检RNA有较完整、清晰的RNA条带。(6)筛选出KEGG通路分析及GO富集分析共同选取的富集度高的3条代谢通路,3条富集通路交集有5个基因分别是ITGA3、ITGA5、ITGAV、CD44和SDC4。(7)目标基因在qRT-PCR实验表达均有增高趋势,其中ITGA5和SDC4基因表达差异最明显。(8)使用siRNA抑制ITGA5、SDC4基因表达,实验中细胞迁移率均明显降低,实验结果与通过敲低DNA-PKcs表达或使用DNA-PKcs激酶活性抑制剂导致细胞迁移率降低趋势具有一致性。结论:(1)研究了人体细胞DNA-PKcs蛋白激酶活性表达具有电离辐射的时间和剂量效应,因此DNA-PKcs蛋白可作为人体细胞基因放射损伤修复机制研究的靶蛋白。(2)成功获得了与U2OS细胞DNA-PKcs蛋白复合体结合的RNA高通量测序库。(3)DNA-PKcs蛋白与ITGA5、SDC4基因可能在细胞运动能力方面有相互调节作用。