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恶性黑色素瘤是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率以每年3-5%的速度快速增长。肿瘤细胞上调表面程序性死亡-配体1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）的表达并通过与T细胞表面的程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1,PD-1）相互作用引起免疫检查点反应以逃避免疫监视。目前,靶向PD-1/PD-L1的药物在治疗肿瘤包括转移性黑色素瘤方面展现出很好的前景,但是患者反应率较低,其具体机制尚不清楚。研究发现,PD-L1不仅高表达于多数肿瘤细胞,也富集于肿瘤细胞分泌的外泌体中,并参与机体免疫系统的抑制。最新研究表明,黑色素瘤细胞PD-L1表达上调,即使在缺乏适应性免疫的情况下仍然促进肿瘤的生长,提示PD-L1除具有免疫抑制作用外,还具有促进肿瘤细胞增殖的能力。我们前期在黑色素瘤细胞系中过表达PD-L1,同样可以促进细胞的增殖能力。据此,我们推测肿瘤细胞PD-L1具有促进细胞增殖的能力,其分泌外泌体到微环境中,所携带的PD-L1除参与免疫抑制外,还促进肿瘤细胞的增殖。为了证实我们的推测,本课题首先利用Tamaxifen诱导的BrafV600E/Pten-/-/Tyr Cre小鼠黑色素瘤模型和人恶性皮肤黑色素瘤细胞系分析PD-L1在肿瘤和黑色素瘤细胞中的表达;利用慢病毒载体构建过表达PD-L1（PD-L1 OE）、敲低PD-L1（PD-L1 shRNA）及其对照（OE-NC、shRNA-NC）稳转A375细胞系,结合NOD/SCID重症联合免疫缺陷小鼠体内移植瘤实验,探究黑色素瘤细胞PD-L1和外泌体PD-L1对黑色素瘤细胞增殖的影响;为进一步探究外泌体PD-L1发挥作用的机制,本课题构建了PD-1过表达（PD-1OE）、对照组（OE-NC）稳转A375细胞系,结合NOD/SCID移植瘤小鼠模型,探究PD-L1发挥作用是否依赖于细胞PD-1。最后,我们利用转录组学分析了PD-L1促进细胞增殖可能参与的信号通路,实验结果如下:1.PD-L1在黑色素瘤和人恶性皮肤黑色素瘤细胞系中高表达。利用Tamoxifen诱导BrafV600E/Pten-/-/Tyr Cre小鼠,成功构建了黑色素瘤小鼠模型;Western blotting结果表明:黑色素瘤小鼠皮肤高表达PD-L1,体外培养的人恶性皮肤黑色素瘤细胞系（SK-MEL-1、SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375、C8161和WM115）均较人正常皮肤黑色素细胞（PIG1）高表达PD-L1。2.PD-L1促进黑色素瘤增殖。成功构建了PD-L1 OE、PD-L1 shRNA、OE-NC、shRNA-NC四种稳转细胞系,EdU实验分析细胞增殖能力,结果显示:PD-L1显著促进A375细胞增殖;将上述四种稳转细胞系腋下注射重症联合免疫缺陷小鼠NOD/SCID,根据测量瘤体体积绘制肿瘤生长曲线,结果表明:PD-L1促进肿瘤生长,而敲低PD-L1显著抑制肿瘤生长。3.肿瘤细胞源外泌体PD-L1促进黑色素瘤细胞生长。利用超速离心法分离A375和上述四种稳转细胞系分泌的外泌体,透射电镜、粒径分析和western blotting对分离的外泌体进行了鉴定,证明本实验采用的分离方法可获得较高纯度的外泌体;用免疫胶体金结合透射电镜方法观察到A375来源的外泌体表达PD-L1蛋白,western blotting结果显示PD-L1蛋白可富集于A375来源的外泌体;将上述四种稳转细胞系来源的外泌体或PD-L1中和抗体与PD-L1 shRNA稳转细胞系共孵育,EdU实验分析细胞增殖情况,结果表明:外泌体PD-L1可显著促进肿瘤细胞增殖;将PD-L1用中和抗体中和后,细胞增殖能力被显著抑制;将上述四种稳转细胞系来源外泌体尾静脉注射于NOD/SCDI移植瘤小鼠体内,显示外泌体PD-L1能够显著促进黑色素瘤的生长,而敲低PD-L1的外泌体显著抑制了肿瘤的生长。4.外泌体PD-L1通过激活黑色素瘤细胞PD-1下游信号通路促进肿瘤生长。通过western blotting分析黑色素瘤和人恶性皮肤黑色素瘤细胞系PD-1蛋白表达,结果显示PD-1在黑色素瘤和黑色素瘤细胞系中也呈现高表达;随后,利用慢病毒表达载体成功构建过表达PD-1（PD-1 OE）和对照（OE-NC）稳转A375细胞系,通过添加过表达PD-L1的外泌体以及选择性添加PD-1中和抗体,EdU实验分析细胞增殖情况,结果发现:PD-1被PD-1中和抗体中和后,细胞增殖能力被显著抑制,PD-1有助于外泌体PD-L1发挥促细胞增殖作用,提示PD-L1促进细胞增殖是由PD-1所介导;将PD-1 OE和OE-NC两种稳转细胞系腋下注射NOD/SCID小鼠构建移植瘤模型,肿瘤生长曲线显示,高表达PD-1的A375细胞系显著促进肿瘤的生长;通过在移植瘤小鼠尾静脉注射过表达PD-L1的外泌体,显示PD-1高表达可促进富含PD-L1外泌体对肿瘤生长的促进作用,表明黑色素瘤外泌体PD-L1可能通过与PD-1相互作用促进细胞增殖;为了探究PD-L1促进细胞增殖的分子机制,本课题利用人PD-L1活性肽刺激PD-1 OE细胞,提取RNA后进行转录组测序,经转录组分析发现,TGF-β、mTOR、Hippo和Hedgehog等通路与PD-L1活性肽刺激有关,我们推测PD-L1可能通过相关通路促进细胞增殖。上述结果表明,黑色素瘤细胞可以分泌富集PD-L1的外泌体,通过PD-L1/PD-1途径促进肿瘤细胞自身增殖,为PD-L1和PD-1在癌症进展中的复杂性提供了新的思路。