研究背景：Wnt/-catenin经典信号通路是指在Wnt信号作用下通过β-catenin传导的信号通路。信号传导过程中，Wnt蛋白与Frizzled家族特异性受体和LRP5/LRP6辅助受体结合，触发细胞内的信号转导，使β-catenin聚集入核，激动靶基因转录，参与调节细胞增殖、分化和迁移等生物学过程。近年来，大量研究及本课题组前期实验观察发现，不同时期的成骨细胞中激活Wnt/β-catenin信号通路均可增加骨量，显示出在骨质疏松等低骨量疾病治疗中的良好应用前景。骨细胞占所有骨组织细胞总量的95%以上，最近研究表明，骨细胞具有内分泌功能，可作用于成骨细胞、破骨细胞和肾脏等，对骨代谢及骨发育有重要调控作用。但目前尚无相关研究报道在骨细胞中持续激活β-catenin对骨量和骨生长有何作用。鉴于骨细胞的数量及其在骨量调控中的重要作用，以及Wnt信号通路在骨量和骨生长中的重要调控作用，我们认为有必要对骨细胞中持续激活β-catenin对骨量和骨生长的作用及机制进行观察。骨硬化蛋白(Sclerostin，SOST)在骨细胞中特异表达，是Wnt/β-catenin信号通路强力抑制因子之一，可抑制骨形成，减少骨量。近年的基础研究和临床观察发现，SOST中和性抗体可增加骨量，在骨质疏松的治疗中效果肯定。目前，尚不清楚其具体的作用机制、可能的副作用以及在其他低骨量的病理状态中有无作用。牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein1，DMP1)是在牙本质和骨细胞中特异表达的一种蛋白，在骨组织矿化及机体磷代谢中有重要调控作用。DMP1基因敲除后一个重要的表型是椎体骨量降低。因而我们试图观察SOST中和抗体是否可以改善DMP1基因敲除小鼠低骨量的表型，并观察其是否有副作用。虽然目前Wnt/β-catenin信号通路在骨量和骨生长调控的重要作用得到证实，但其下游可能相互作用的转录因子及具体机制尚不清楚。Osterix是成骨细胞特异性转录因子，在成骨细胞分化及骨形成过程中必不可少。有研究表明，Osterix和Wnt/β-catenin信号通路相互作用，在成骨细胞等的增殖、分化中发挥重要作用。因而我们推测Osterix可能是Wnt/β-catenin信号通路重要的下游作用分子（之一）。综上，目前已经证实Wnt/beta-catenin信号通路在骨量和骨生长调控中发挥重要作用，但仍存在如上述诸多不明了的问题。为此，我们拟开展以下实验：1.观察在骨细胞中持续激活β-catenin后对骨量和骨生长的影响，并探索其可能机制。2.观察SOST中和抗体对正常小鼠和一种特殊的低骨量小鼠（DMP1基因敲除小鼠）的骨量和骨生长的调控作用。3.观察Osterix对骨量和骨生长的调控作用，并探索其可能机制。实验方法：第一部分：骨细胞中持续激活β-catenin对小鼠骨量和骨生长影响1.建立骨细胞特异性持续激活β-catenin小鼠模型，并观察有无骨骼畸形，测量体重和下肢骨长度；2.利用X线摄片、Micro CT， H&E染色等观察小鼠骨密度及骨组织结构情况；3. TRAP染色观察破骨细胞数量及功能，BrdU免疫组织化学检测成骨细胞增殖情况，TUNEL法观察成骨细胞和生长板肥大层细胞凋亡情况，采用ELISA方法检测血清中成骨及破骨的生化指标Osteocalcin和CTX1的含量；4.利用免疫组织化学染色检测成骨细胞标志物RunX2、Osterix，破骨细胞标志物RANKL，骨矿化抑制因子OPN、FGF23，Wnt/β-catenin信号抑制因子Dkk1，以及血管标记CD31因子的表达；5.采用三点弯曲试验测试小鼠长骨生物力学特性，硬组织切片钙化结节染色观察骨组织矿化水平，Masson染色观察长骨胶原成分含量，测定血清中碱性磷酸酶及钙、磷含量，观察小鼠钙磷代谢是否正常；6.小鼠长骨原代成骨细胞及骨细胞体外分离培养，并进行成骨诱导，茜素红染色观察矿化水平，提取细胞总RNA，实时定量PCR检测骨形成与骨吸收相关基因Dkk1、RANKL、OPG的表达。第二部分：SOST中和抗体对正常小鼠和DMP1基因敲除小鼠骨量和骨生长影响1.实验小鼠的分组给药：DMP1敲除小鼠与野生型小鼠分别随机分为SOST中和抗体处理组与对照组。出生后4周及12周开始，处理组给予SOST中和抗体10mg/kg腹腔注射，对照组给予等体积生理盐水，一周两次给药，连续8周；2. X线摄片、Micro CT扫描及HE染色观察小鼠椎体骨密度，松质骨骨量及骨组织结构情况；3. Safranin O染色观察骨组织软骨成分含量，TRAP染色观察破骨细胞活性；4.免疫组织化学染色检测成骨与破骨活动相关标志物PHEX、BSP、RANKL、β-catenin以及FGF23的表达。第三部分：Osterix核转录因子对小鼠骨量和骨生长发育的影响1.建立成骨细胞条件性敲除及过表达Osterix基因小鼠模型，观察小鼠体型，身长，脊柱发育有无畸形；2. X线摄片、HE染色观察椎体骨密度，骨量以及椎体结构有无异常；3.采用TRAP染色观察椎体骨组织破骨细胞活性，Safranin O染色观察椎体骨中软骨成分含量，TUNEL法检测生长板肥大细胞凋亡情况；4.尼氏染色观察神经元损伤情况；5.免疫组织化学染色检测成骨细胞、骨细胞及破骨细胞标志物TNAP、BSP、PHEX、SOST、RANKL，血管标志物CD31的表达。实验结果：一、骨细胞中持续激活β-catenin导致骨量显著增加，但骨强度及骨发育受损1．骨细胞中持续激活β-catenin（CA-β-catenin）小鼠体型体型小，下肢骨长度明显变短，绝大部分小鼠在出生后5-6周死亡； CA-β-catenin小鼠长骨生长板CD31表达下降，肥大层细胞凋亡减弱。2．CA-β-catenin小鼠松质骨骨量明显增多，几乎填满整个骨髓腔。Micro CT结果显示骨体积与组织体积比(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)等在CA-β-catenin小鼠中均显著升高。3．CA-β-catenin小鼠破骨细胞活动明显增强。其松质骨中TRAP染色阳性细胞增多，破骨细胞标志RANKL表达水平明显升高，血清中骨吸收标志CTX1含量增加，体外分离培养骨细胞中RANKL/OPG基因表达比值也显著升高。4．CA-β-catenin小鼠成骨细胞增殖及活性显著增加。其成骨细胞标志RunX2、Osterix表达升高，BrdU检测成骨细胞增殖活动加强，血清检测骨形成标志碱性磷酸酶及骨钙蛋白含量上升；而Wnt/β-catenin信号通路的抑制因子Dkk1在CA-β-catenin小鼠中表达下降，同时β-catenin在成骨细胞中信号明显增强。5． CA-β-catenin小鼠长骨骨质量明显下降。其反应生物力学特性的断裂载荷及刚度两项指标均下降，Micro CT重建显示皮质骨不连续且孔隙明显增多。骨组织钙化结节染色以及骨细胞诱导后茜素红染色均可见CA-β-catenin小鼠的骨矿化水平降低，且OPN、FGF23等骨矿化抑制因子的表达升高。此外，CA-β-catenin小鼠血清钙磷水平降低，提示骨代谢异常。二、SOST中和抗体通过激活wnt/β-catenin信号通路改善DMP1基因敲除小鼠骨量下降的表型。1．DMP1基因敲除（DMP1KO）小鼠脊柱椎体骨密度及骨量明显下降，给予连续8周的SOST中和抗体治疗后，骨量丢失得到明显的改善，甚至超过同龄正常野生小鼠。2．SOST中和抗体可促进DMP1KO小鼠椎体成骨细胞分化成熟。经SOST中和抗体治疗DMP1KO小鼠椎体中成骨中期标志PHEX表达下降，成骨晚期成熟标志BSP表达上升。3．SOST中和抗体可抑制DMP1KO小鼠椎体破骨细胞活动。SOST中和抗体处理组DMP1KO小鼠椎体TRAP染色阳性结果减少，RANKL表达水平明显降低。4．SOST中和抗体激活DMP1KO小鼠椎体中β-catenin信号。5．SOST中和抗体对DMP1KO小鼠脊柱生长受阻无缓解作用。三、成骨细胞中条件性敲除Osterix基因导致椎体骨量增加，出现严重脊柱畸形，过表达Osterix对脊柱发育无明显影响。1．Osx-KO小鼠椎体骨量明显增加。骨组织中Dkk1表达下降，β-catenin的表达水平升高，可能激活Wnt/β-catenin信号通路，可能是骨量增加的机制。2．成骨细胞条件性敲除Osterix基因（Osx-KO）小鼠出现严重脊柱侧凸畸形，与人类先天性脊柱侧凸表现一致。3．Osx-KO小鼠胸腰段椎体正常结构破坏，进而出现严重脊髓损伤表现。4．成骨细胞中过表达Osterix基因对脊柱发育无不利影响。结论：一、骨细胞中持续激活β-catenin后，小鼠的松质骨骨量显著增加，同时骨质量下降，容易发生骨折，且小鼠的骨发育受阻。骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路对维持正常骨量有重要调控作用，主要作用机制是调节成骨细胞和破骨细胞之间的平衡得以实现。二、 SOST中和抗体可增加正常小鼠和DMP1敲除小鼠脊椎骨量，其作用是通过激活β-catenin实现的。三、Osterix敲除小鼠脊椎中骨量显著增加，其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路实现的。但同时Osterix敲除小鼠脊柱发育严重障碍，出现脊柱侧弯等畸形。