前言灵杆菌多糖是从灵杆菌菌体中提取精制得到的脂多糖物质,目前国内注册的英文通用名为hemarisin,国内曾经称灵杆菌多糖为“灵杆菌素”,国外,尤其是前苏联或俄罗斯所报道的同类产品叫做prodigiozan。由于灵杆菌(Bacillus prodigiosus)是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的老式叫法,因此,灵杆菌多糖和prodigiozan都是从粘质沙雷氏菌或灵杆菌中提取的脂多糖类物质。灵杆菌多糖虽然也是属于细菌内毒素的范畴,但其毒性极低,具有免疫促进作用,在临床主要用于各种原因引起的白细胞减少症、乙型肝炎及急慢性盆腔炎等疾病的辅助治疗。目的在药物筛选过程中,我们发现灵杆菌多糖具有明显的抗内毒素作用,据此,本研究采用动物模型对灵杆菌多糖的抗内毒素作用进行确证,并从不同角度探讨灵杆菌多糖抗内毒索的作用机制,为理解灵杆菌多糖的临床用途提供新的视角,同时为灵杆菌多糖用于内毒素血症的辅助治疗提供前期实验依据。研究内容1.灵杆菌多糖对小鼠内毒素休克及内毒素血症模型的影响1.1灵杆菌多糖对小鼠内毒素休克致死模型的保护作用1.1.1材料与方法先给KM小鼠(以下称：小鼠)腹腔注射灵杆菌多糖或生理盐水或阳性对照药物,0.5h后,每组动物均腹腔注射内毒素(铜绿假单胞菌脂多糖,LPS)60mg/kg,观察3d内动物死亡情况。1.1.2结果腹腔注射大剂量LPS(60mg/kg)后,小鼠出现明显的中毒反应,20h后陆续有动物死亡,48h后仍存活的动物逐渐恢复正常活动与摄食。灵杆菌多糖(100、50U/kg)预防性腹腔注射给药使动物存活率分别提高60%和45%(χ2=15.000,P=0.000；χ2=9.231,Bonferroni校正P=0.006)。1.2灵杆菌多糖对内毒素血症模型小鼠炎症相关因子产生的抑制作用1.2.1材料与方法先给小鼠腹腔注射灵杆菌多糖或生理盐水或阳性对照药物,0.5h后,正常对照组动物腹腔注射等体积生理盐水,其余动物均腹腔注射LPS(10mg/kg),导致内毒素血症。3h后,小鼠摘眼球放血制备血清,ELISA方法测定血清中白介素-1p(IL-1p)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF α)、前列腺素E2(PGE2)的含量。Griess法检测一氧化氮(NO)的含量。1.2.2结果小鼠腹腔注射LPS后,其血清中IL-1β、IL-6、TNF α、PGE2、NO的含量明显升高,预先给予灵杆菌多糖(100,50U/kg)腹腔注射,然后再给LPS,其血清中各指标升高的幅度明显下降,灵杆菌多糖组各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(IL-1β：P=0.007,P=0.023；IL-6：P=0.018,P=0.046,TNFα：P=0.001,P=0.019;PGE2：P=0.001,P=0.009：NO：P=0.012,P=0.039)。1.3灵杆菌多糖对内毒素血症模型小鼠炎症相关基因mRNA表达的抑制作用1.3.1材料与方法动物分组及处理同1.2.1节,小鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)3h后,脱颈椎处死,取出脾脏置液氮中保存,提取总RNA,实时荧光定量PCR法检测IL-1p、IL-6、TNFα、COX-2(环氧酶-2)、iNOS(诱导型一氧化氮合酶)mRNA的相对含量(2-△Ct,以GAPDH为内参)。1.3.2结果小鼠腹腔注射LPS后3h,脾脏中IL-1β、IL-6、TNFα、COX-2、iNOS mRNA的表达明显增多,提前0.5h腹腔注射灵杆菌多糖(100,50U/kg)可部分抑制由LPS诱导的上述各目的基因mRNA的表达,灵杆菌多糖组各参数均数与LPS组相比,剂量为100U/kg时,差异均有统计学意义(IL-1β：P=0.026；IL-6：P=0.015；TNF仅：P=0.029：COX-2：P=0.016；iNOS:P=0.020)；剂量为50U/kg时,差异有些有统计学意义(IL-1β：P=0.072；IL-6：P=0.035；TNF α：P=0.069；COX-2：P=0.034；iNOS:P=0.399)。2.灵杆菌多糖对体外内毒素激活小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症相关因子及表达炎症相关基因的影响2.1灵杆菌多糖对内毒素激活小鼠腹腔巨噬细胞产生炎症相关因子的抑制作用2.1.1材料与方法LPS(10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬细胞活化作为体外炎症模型。微量96孔板作为培养载体,ELISA法检测培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2的含量；Griess法检测NO的含量。2.1.2结果在LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞16h后,培养上清中促炎细胞因子IL-1p、IL-6、TNF-a及培养24h后炎症因子或介质PGE2、NO的含量大幅增加,灵杆菌多糖(20、10U/mL)能部分抑制由LPS诱导的上述促炎细胞因子及炎症因子或介质的分泌,灵杆菌多糖组各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(IL-1β：P=0.001,P=0.016；IL-6：P=0.001,P=0.016；TNF-α：P=0.027,P=0.046；PGE2：P=0.010,P=0.038；NO：P=0.000,P=0.001)2.2灵杆菌多糖对内毒素激活小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症相关基因mRNA的抑制作用2.2.1材料与方法LPS(10μg/ml)刺激小鼠腹腔巨噬细胞活化作为体外炎症模型。6孔板作为培养载体,实时荧光定量PCR法检测目的基因mRNA的相对含量(2-△Ct,以GAPDH为内参)。2.2.2结果经过LPS体外刺激16h后,小鼠腹腔巨噬细胞IL-1p、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS mRNA的表达明显增多,灵杆菌多糖(20、10U/mL)可部分抑制由LPS诱导的上述目的基因mRNA的表达,灵杆菌多糖组各指标均数与LPS组相比,差异有统计学意义(IL-1β：P=0.001,P=0.009；IL-6：P=0.000,P=0.000；TNF-a：P=0.000,P=0.000；COX-2：P=0.000,P=0.001；iNOS:P=0.011,P=0.021)3.灵杆菌多糖单独给药对小鼠产生促炎细胞因子的影响3.1灵杆菌多糖对正常小鼠血清促炎细胞因子水平的影响3.1.1材料与方法小鼠腹腔注射灵杆菌多糖或生理盐水或LPS,3h后,小鼠摘眼球放血制备血清,ELISA方法测定血清中IL-1β、IL-6、TNF α的含量。3.1.2结果正常小鼠血清细胞因子IL-1p、IL-6、TNF α的含量很低,灵杆菌多糖(100、50U/kg)腹腔注射给药使上述细胞因子的血清含量有提升趋势,但均数与生理盐水组相比,差异无统计学意义(IL-1β：P=0.377,P=0.658；IL-6：P=0.903,P=0.994：TNF a：P=0.369,P=0.997)3.2灵杆菌多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞产生促炎细胞因子的影响3.2.1材料与方法小鼠腹腔巨噬细胞体外培养模型,微量96孔板作为培养载体,ELISA法检测培养上清中IL-1p、IL-6、TNF-α的含量。3.2.2结果在体外培养的条件下,灵杆菌多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1β、IL-6、TNF-α均有弱的促进作用,在浓度为20U/mL时,其均数与全培组相比,差异有统计学意义(P=0.007,P=0.002,P=0.003)。在浓度为10U/mL时,有些有统计学意义(P=0.043,P=0.536,P=0.016)。4.灵杆菌多糖对内毒素所致小鼠肺损伤的保护作用4.1灵杆菌多糖抑制内毒素诱导的肺氧化损伤作用4.1.1材料与方法除LPS为静脉给药外,动物分组及处理同1.2.1节,小鼠尾静脉注射LPS(30mg/kg)6h后,腹腔注射麻醉,开胸取出全肺,经后续处理后,测量肺湿重干重比(W/D)、髓过氧化物酶(MPO)活力、丙二醛(MDA)含量。4.1.2结果小鼠静脉注射LPS6h后,出现明显肺水肿现象,肺组织中MPO的活性及MDA的含量均明显增加。预先腹腔注射灵杆菌多糖(100、50U/kg)可减轻由LPS引起的肺水肿现象,肺组织湿重与干重的比值下降,当灵杆菌多糖剂量为100U/kg时其均数与LPS组相比,差异有统计学意义(P=0.010),剂量为50U/kg时差异无统计学意义(P=0.060)。预先腹腔注射灵杆菌多糖(100、50U/kg)可部分抑制由LPS引起的MPO活性及MDA含量的增加,其均数与内毒素模型组相比,差异有统计学意义(MPO：P=0.001,P=0.010；MDA：P=0.000,P=0.002)。4.2灵杆菌多糖抑制内毒素诱导肺内促炎细胞因子产生的作用4.2.1材料与方法除LPS为静脉给药外,实验分组及给药同1.2.1节,小鼠均尾静脉注射LPS(30mg/kg),3h后,腹腔注射麻醉,开胸取出肺脏,经冷冻后制备肺组织匀浆,ELISA法测定上清中IL-1β、IL-6和TNF α的含量。4.2.2结果小鼠静脉注射LPS3h后,肺组织中IL-1β、IL-6和TNFα的含量明显增加。预先腹腔注射灵杆菌多糖(100、50U/kg)可部分抑制由LPS引起的IL-1β、IL-6和TNFα的增加,当灵杆菌多糖剂量为100U/kg时其均数与LPS组相比,差异均有统计学意义(P=0.029,P=0.010,P=0.006)；剂量为50U/kg时,差异有些有统计学意义(P=0.695,P=0.065,P=0.017)。5.灵杆菌多糖对内毒素所致小鼠肝损伤的保护作用5.1灵杆菌多糖对内毒素诱导肝细胞损伤的保护作用5.1.1材料与方法除LPS为静脉给药外,动物分组及处理同1.2.1节,小鼠均尾静脉注射LPS(30mg/kg),6h后,小鼠摘眼球取血,制备血清用于谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)检测。5.1.2结果小鼠静脉注射LPS6h后,血清中ALT和AST的活性明显升高,预先腹腔注射灵杆菌多糖(100、50U/kg)可部分抑制由内毒素引起的ALT和AST活性的升高,当灵杆菌多糖剂量为100U/kg时其均数与LPS组相比,差异均有统计学意义(P=0.022,P=0.026)；剂量为50U/kg时,AST的差异有统计学意义(P=0.031)。5.2灵杆菌多糖对内毒素诱导肝组织促炎细胞因子mRNA表达的抑制作用5.2.1材料与方法实验分组及给药同1.2.1节,小鼠均腹腔注射LPS(30mg/kg),3h后,脱颈椎处死,取出肝脏置液氮中保存,提取总RNA,实时荧光定量PCR法检测IL-1p、IL-6、TNF αmRNA的含量。5.2.2结果小鼠腹腔注射细菌LPS后3h,肝脏中IL-1β、IL-6、TNF αmRNA的表达明显增多,提前0.5h腹腔注射灵杆菌多糖(100,50U/kg)可部分抑制由LPS诱导的IL-1p、IL-6、TNFαmRNA的表达,当灵杆菌多糖剂量为100U/kg时其均数与LPS组相比,差异均有统计学意义(P=0.020,P=0.012,P=0.014)；剂量为50U/kg时,IL-6和TNFα mRNA的差异有统计学意义(P=0.043,P=0.020)。统计学处理应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。存活率以百分数表示,先采用R×C表资料的卡方检验对各组动物存活率差异进行多组间的总体检验,然后采用四格表资料的卡方检验进行组间存活率的两两比较。定量数据结果以均数±标准差表示,采用单向方差分析法分析,先进行方差齐性检验,若方差齐用LSD方法多重比较；若方差不齐,采用经Welch法校正方差分析的F和P值,用Dunnett’s T3法多重比较。显著性水准取α=0.05,以P<0.05时,组间差异判断为具有统计学意义。结论(1)灵杆菌多糖预防性腹腔给药可减少内毒素致小鼠死亡的百分率。(2)灵杆菌多糖预防性腹腔给药可部分抑制由内毒素所致小鼠血清IL-1β、IL-6、TNFα、PGE2、NO含量的升高。(3)灵杆菌多糖预防性腹腔给药可部分抑制由内毒素所致小鼠脾脏IL-1pIL-6、TNFa、COX-2、iNOSmRNA的表达。(4)灵杆菌多糖体外可部分抑制内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1p、IL-6、TNF-a、PGE2、NO。(5)灵杆菌多糖体外可部分抑制内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞IL-1p、IL-6、TNF-α、COX-2、iNOS mRNA的表达。(6)灵杆菌多糖体外可轻微刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1p、IL-6、TNF-a,其作用明显弱于内毒素。(7)灵杆菌多糖预防性腹腔给药对内毒素所致小鼠肺损伤有一定的保护作用。(8)灵杆菌多糖预防性腹腔给药对内毒素所致小鼠肝损伤有一定的保护作用。(9)由于慢性偷腔炎和乙型肝炎时均伴有局部内毒素浓度的升高,灵杆菌多糖临床上对上述病症有良好疗效的机制可能与拮抗内毒素有关。(10)灵杆菌多糖与内毒素都属于细菌脂多糖,而细菌脂多糖作用的主要受体为TLR4(Toll-like receptor4)。灵杆菌多糖刺激作用弱,没有明显的毒性；而内毒素刺激作用强,有明显的毒性反应；提示灵杆菌多糖为部分激动剂,而内毒素为完全激动剂,两者同时存在时前者对后者的毒性作用有拮抗作用,不过,其确切机制有待进一步的研究。