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在临床上,耳聋是最常见的遗传性疾病之一。耳聋的常见病因包括环境因素(约占20-40%)和遗传因素(约占60-80%)。其中,大多数的遗传性耳聋是由单基因缺陷而导致的。本研究前期工作中,应用全外显子组测序技术,检测到了 1个耳聋新基因WYF1,DFNA5的1个新致病性突变p.E375X,和OTOF基因的3个新致病性突变p.L517P,p.I1967del和p.LTV1557-9del。本研究工作主要针对上述致病性突变,应用CRISPR/Cas9系统构建斑马鱼模型,并对其进行功能和致病机制研究。本研究概述如下:第一部分WYF1基因斑马鱼模型构建及致聋机制研究WYF1基因的p.D326AfsX42移码突变与FJ-C199家系的耳聋表型共分离。WYF1为转录因子,在鼠、斑马鱼和鸡胚的耳泡和眼泡中均有表达。本课题组成功应用CRISPR/Cas9系统构建了wyflb突变体斑马鱼模型,突变位点与人类相似,均位于第5外显子。wyflb突变体斑马鱼的成活率及繁殖能力均明显低于野生型,部分个体出现明显的心脏发育异常。斑马鱼突变体和Morphants的部分个体中出现耳石融合;翻正反射试验和前庭眼动反射试验均提示wyflb突变体纯合子与杂合子的平衡功能异常,其听功能初步检测存在异常,但仍需要进一步验证。wyflb纯合体的内耳及侧线的毛细胞的数量和形态均未见明显异常,提示Wyflb可能不参与毛细胞发育的调控。第二部分 DFNA5基因斑马鱼模型构建及功能探索在GD-H238家系中检测到的DFNA5基因突变p.E375X位于第8外显子,是迄今第一个发现的位于DFNA5外显子区域的的致病性突变,该发现将有助于开启人类对DFNA5的致聋机制的新认识。本课题组应用新兴的CRISPR/Cas9技术,成功构建了 2种dfna5突变体斑马鱼模型:p.T328X和p.T328NfsX7。突变p.T328X与在病人中检测到的致病性突变p.E375X情况更为类似,很好地模拟了人的致病性突变。dfna5b突变体从幼鱼至成鱼各时期的发育均未见明显异常,0-7dpf的内耳结构未见明显异常。功能实验结果提示dfna5b突变体幼鱼和成鱼均无明显的前庭-听功能障碍。dfna5b突变体的毛细胞结构、数量均与野生型之间无明显差异,提示其毛细胞未受累。