论文部分内容阅读
目的：研究β2-糖蛋白Ⅰ（β2-gpⅠ）对THP-1来源的巨噬细胞吞噬凋亡HL-60细胞的影响，并探讨其作用机制。方法：体外培养人急性髓系白血病细胞株HL-60，用阿糖胞苷（Ara-C）诱导其凋亡并用MTT法和AnnexinV-PI联合染色法检测细胞生长抑制率和凋亡情况；体外培养人急性单核细胞白血病细胞株THP-1，用佛波酯（PMA）诱导其分化为吞噬细胞，流式细胞仪检测诱导分化后细胞表面抗原CD11b表达情况以确定分化程度，墨汁吞噬实验检测分化后细胞的吞噬能力；ELISA法检测PS与β2-gpⅠ的特异结合情况；流式细胞仪检测β2-gpⅠ与AnnexinV竞争结合磷脂酰丝氨酸（PS）情况；在β2-gpⅠ存在的条件下，观察其对吞噬细胞吞噬凋亡细胞的吞噬率影响。结果：1、Ara-C体外诱导HL-60细胞凋亡：不同浓度Ara-C分别作用HL-60细胞24、48小时后，细胞出现典型的凋亡形态：细胞体积变小，细胞核固缩变小或碎裂，染色质浓缩或边集等。MTT法检测细胞生长抑制率结果显示细胞生长抑制率随着药物浓度增加而增大，流式细胞仪检测凋亡率显示随着Ara-C浓度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐增大。Ara-C浓度为800ug/ml作用HL-60细胞48h后，细胞生长抑制率达到72.50±1.64%，早期凋亡率和晚期凋亡率分别达到19.35±0.44%，53.56±2.90%，细胞抑制率和凋亡率远大于对照组（P<0.05）。2、PMA诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞：150ng/ml PMA诱导THP-1细胞72h后，细胞形态上出现明显变化：细胞体积增大，形态不规则伸出伪足。流式细胞仪检测诱导48h后细胞表面CD11b表达水平显示:50、100、150、200ng/ml PMA诱导后细胞表面CD11b阳性率分别为17.71±0.49%、18.77±0.66%、22.93±0.53%、21.29±0.87%，实验组CD11b阳性率均明显高于对照组（P<0.05）。PMA诱导72h后，上述各浓度组CD11b阳性率分别为43.89±1.64%、49.14±0.72%、54.88±1.73%、52.11±0.81%。相同浓度PMA诱导72h细胞表面CD11b阳性率均比诱导48h的阳性率显著增高（P<0.05）。吞噬能力检测显示用150ng/ml PMA诱导THP-1细胞72h后，吞噬能力达到90%以上。3、PS与β2-gpⅠ的特异性结合：ELISA实验结果显示实验组OD值>临界值，结果阳性，说明β2-gpⅠ可以与PS特异性结合。4、β2-gpⅠ与AnnexinV竞争结合磷脂酰丝氨酸(PS）：流式细胞仪检测结果显示：随着β2-gpⅠ浓度的增加,AnnexinV与早期凋亡细胞的结合率逐渐降低。加入AnnexinV避光反应40min后，无β2-gpⅠ时，AnnexinV（+）PI（-）率为22.72%，加入β2-gpⅠ100ul、200ul、400ul后AnnexinV（+）PI（-）率分别为21.43%、13.15%、8.51%，加β2-gpⅠ前后比较差异有显著性意义（P<0.05）。β2-gpⅠ可以与AnnexinV竞争结合同一位点即PS。β2-gpⅠ与早期凋亡细胞的结合率随着时间的增加有所降低。5、β2-gpⅠ对吞噬率的影响：无β2-gpⅠ时吞噬细胞的吞噬率为10.5%,分别加入50ug/ml、100ug/ml、150ug/mlβ2-gpⅠ后吞噬率为16.8%、33.6%、42.7%，加入β2-gpⅠ后与无β2-gpⅠ时比较吞噬率增加。结论：β2-gpⅠ可以和凋亡细胞特异性结合，并增强吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬率。