黏膜免疫在维持机体局部免疫稳态中发挥关键作用,其中免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)是黏膜免疫应答的主效应分子。本文拟通过分子生物学、免疫组织化学、统计学等方法制备高效特异的抗双峰驼IgA抗体,旨在为深入探讨双峰驼IgA在机体中的相关免疫学功能提供依据与材料支持,进而为揭示双峰驼黏膜免疫机制奠定基础。本文首先对双峰驼IgA的生物信息进行了分析。通过DNAMAN、BepiPred 2.0等软件对双峰驼IgA重链恒定区(IgA-H)进行一级结构的差异性分析、B细胞抗原表位预测,结合筛选出一段具有代表性的基因序列(F-IgA-H),并使用ProtParam对IgA-H和F-IgA-H的理化性质进行分析。之后分别构建了二者的原核表达质粒pET-28a-IgA-H和pET-28a-F-IgA-H,诱导其在BL21中表达,并优化培养条件,SDS-PAGE和Western Blot验证其表达结果。之后再用纯化的重组蛋白分别制备兔抗双峰驼IgA-H多克隆抗体(PAb-H)与兔抗双峰驼F-IgA-H多克隆抗体(PAb-F),ELISA和Western Blot检测抗体效价和特异性。最后以SABC免疫组化方法验证生物信息学筛选结果,image-Pro Plus计算3种抗体(PAb-H、PAb-F、本实验室保存兔抗双峰驼IgA多克隆抗体(PAb-N))在各年龄组双峰驼腭扁桃体中IgA~+细胞密度,并使用SPSS21.0单因素方差分析其差异性。结果表明:(1)通过生物信息学分析筛选出典型的双峰驼IgA片段F-IgA-H。(2)本研究分别成功构建了含有IgA-H与F-IgA-H基因的原核表达质粒,并获得重组蛋白。重组蛋白IgA-H主要以包涵体形式表达,大小约为39 KD,最佳诱导表达条件为IPTG 0.1 mmol/L、诱导时间6 h;重组蛋白F-IgA-H在上清中表达,大小约为20 KD,最佳诱导表达条件为IPTG 0.15 mmol/L、诱导时间4 h。(3)ELISA结果显示,PAb-F的效价(1:64000)高于PAb-H(1:32000),Western Blot证实制备的两种多抗都能特异性识别重组蛋白。(4)SABC结果显示,PAb-F的工作浓度(1:900)高于PAb-H(1:400);各年龄组的左、右腭扁桃体的IgA~+细胞密度差异不显著(P>0.05);幼年组腭扁桃体的IgA~+细胞分布密度显示,PAb-F与PAb-H差异显著(P<0.05),与PAb-N差异不显著(P>0.05);青年组腭扁桃体的IgA~+细胞分布密度显示,PAb-F、PAb-H、PAb-N三者之间差异显著(P<0.05);壮年组腭扁桃体的IgA~+细胞分布密度显示,PAb-F与PAb-H、PAb-N差异显著(P<0.05)。通过生物信息学对双峰驼IgA特异性抗原表位的分析而筛选出的片段F-IgA-H制备的PAb-F,其效价和免疫组化工作浓度都高于PAb-H与PAb-N,免疫组化验证差异性分析也显示PAb-F更为高效特异,与生物信息学分析筛选结果一致,可以为揭示双峰驼黏膜免疫机制奠定基础。