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目的研究叶酸对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖、分化、凋亡作用的影响及加入U0126作用下叶酸对NSCs增殖、分化作用的影响,并探讨其机制。1.建立体外神经干细胞培养模型。2.通过镜下初步观察、MTT法检测叶酸对NSCs增殖的影响。3.通过共聚焦激光扫描荧光双重染色,计数双阳性细胞比例检测NSCs分化情况。4.通过流式细胞仪检测叶酸对NSCs凋亡率影响。方法1.NSCs原代培养方法建立:通过机械吹打法获得胚胎鼠、新生鼠大脑皮质NSCs,利用含有bFGF和EGF因子的无血清培养液培养细胞,获得NSCs。2.试验分组:选用孕鼠、新生鼠大脑皮质NSCs。分为四组:①正常对照组(Control组);②叶酸低剂量组(Folate-L组);③叶酸高剂量组(Folate-H组);④叶酸缺乏组(MTX组)。U0126作用下,分组为:①正常对照组(Control组);②U0126组(U0126);③U0126+低剂量叶酸组(U0126+low folic acid,U0+LFA);④U0126+高剂量叶酸组(U0126+high folic acid,U0+HFA)。首先收集应用无血清培养基培养的增殖6 d的部分细胞,然后将剩余的NSCs细胞加血清使之分化,继续培养6 d,收集分化的神经细胞。3.叶酸对NSCs增殖的研究:倒置显微镜下初步观察叶酸对NSCs增殖影响,MTT法观察叶酸对NSCs增殖的影响并绘制生长曲线。4.叶酸对NSCs分化的研究:倒置显微镜下初步观察叶酸对NSCs分化影响,共聚焦激光扫描荧光双重染色观察叶酸对NSCs分化为神经元和星型胶质细胞比例的影响。5.叶酸对胚胎鼠NSCs凋亡的影响:流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果1.通过机械吹打法、含bFGF、EGF的无血清培养基培养的NSCs表达Nestin抗原,BrdU标记显示有增殖能力,能分化为表达β-tubulin-Ⅲ的神经元和GFAP的星型胶质细胞,证明所培养的细胞为NSCs。2.叶酸对体外培养的胚胎大鼠和新生鼠NSCs增殖作用的研究:MTT结果显示:4μg/ml、40μg/ml浓度的叶酸均促进NSCs增殖,40μg/ml作用明显,MTX抑制胚胎大鼠和新生鼠NSCs的增殖;U0126作用下,对照组U0126组比较差别有统计学意义(P＜0.05),U0+LFA和U0+HFA与U0126比较差别无统计学意义(P＞0.05)。3.叶酸对体外培养的胚胎大鼠和新生鼠NSCs分化作用的共聚焦激光扫描荧光双重染色研究结果:①叶酸对胚胎鼠NSCs向星型胶质细胞分化的比例:Folate-H组与Control组比较,Folate-H组与Folate-L组比较,Folate-H组与MTX组比较,差别均有统计学意义(P＜0.05)。叶酸对新生鼠NSCs向星型胶质细胞分化的比例:Folate-H组与Control组比较,MTX组与Folate-L组比较,MTX组与Folate-H组比较,差别有统计学意义(P＜0.05)。②U0126作用下,叶酸对胚胎鼠NSCs向星型胶质细胞分化的比例:Control组与U0126组比较,差别有统计学意义(P＜0.05),其余各组之间差别无统计学意义(P＞0.05)。叶酸对新生鼠NSCs向星型胶质细胞分化的比例:Control组与U0126组比较,差别有统计学意义(P＜0.05),其余各组之间差别无统计学意义(P＞0.05)。③叶酸对胚胎鼠NSCs向神经元分化的比例:各组之间比较,差别均无统计学意义(P＞0.05)。叶酸对新生鼠NSCs向神经元分化的比例:各组之间比较,差别均无统计学意义(P＞0.05)。4.流式细胞仪结果显示胚胎鼠NSCs凋亡率:增值期,Folate-L和Folate-H与Control组比较,两组凋亡率均低于Control组,差别有统计学意义(P＜0.05),Folate-L和Folate-H与MTX组比较,两组凋亡率均低于MTX组,差别有统计学意义(P＜0.05)。分化期,Control组与Folate-L组、Folate-H组和MTX组三组之间比较,Control组凋亡率高于Folate-L组、Folate-H组凋亡率,而低于MTX组凋亡率,差别均有统计学意义(P＜0.05),Folate-L和Folate-H与MTX组比较,两组凋亡率均低于MTX组,差别有统计学意义(P＜0.05)。结论1.本试验成功的分离了胚胎鼠及新生鼠大脑NSCs,胚胎鼠和新生鼠均具有神经干细胞的基本特征:表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin;具有分裂增殖能力;可以分化为神经元和神经胶质细胞。2.叶酸促进体外培养的孕14-16 d胚胎大鼠和24 h内新生鼠NSCs增殖,加入U0126作用下,U0126抑制叶酸诱导NSCs增殖的作用,提示叶酸可能通过MAPK通路起到促进NSCs增殖的作用。3.叶酸促进体外培养的孕14-16 d胚胎大鼠和24 h内新生鼠NSCs向星型胶质细胞方向分化,而向神经元方向分化作用不明显。叶酸可能通过MAPK信号通路促进体外培养的E14-16 d胚胎大鼠和24 h内新生鼠NSCs向星型胶质细胞方向分化。4.叶酸能够抑制胚胎鼠增值期NSCs的凋亡率和分化期神经细胞的凋亡率。