肝细胞癌（HCC）是最常见的、危害最大的恶性肿瘤之一，死亡率居全球恶性肿瘤的第三位。其治愈率低，预后差，容易复发转移。据报道，肿瘤的发生发展与其所处的微环境密切相关。肝癌微环境主要由肝癌细胞和其周围肝星状细胞、淋巴细胞、纤维母细胞、kupffer细胞、上皮细胞、肿瘤血管和淋巴管组成细胞、免疫细胞以及它们的分泌物质和代谢产物等成分构成。其中，树突状细胞（DC）作为体内功能最强大的抗原提呈细胞（APC），在调节T细胞介导的抗肿瘤免疫应答中发挥着非常重要的作用。成熟DC（mDC）高表达MHCⅡ，与肿瘤抗原结合后形成抗原肽-MHCⅡ复合体，将肿瘤抗原呈递给T细胞，使T细胞分化成具有杀伤能力的细胞毒性T细胞，从而有效抑制肿瘤细胞免疫逃逸。然而，肿瘤微环境中存在着多种导致免疫低下甚至免疫不应答的因素。转化生长因子β（TGF-β）是一种广泛存在于肿瘤微环境中的多功能细胞因子，能够抑制免疫功能、调节细胞的生长和分化，且对多种肿瘤细胞具有抑制增殖或促进凋亡作用。大量研究表明，TGF-β对免疫细胞的调节作用十分复杂。调节性T细胞（Treg）是一种表达CD4、CD25和转录因子Foxp3的T细胞亚群，在肿瘤免疫中起负向调控作用。本研究旨在观察在HCC发生发展过程中，TGF-β水平、DC表型及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的动态变化，分析三者之间是否存在一定联系，在此基础上进行一系列体外试验以进一步探讨TGF-β对肿瘤相关免疫细胞的调节作用以及可能的分子机制。目的：观察二乙基亚硝胺（DEN）诱导大鼠HCC过程中，TGF-β水平、DC表型及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的动态变化，揭示TGF-β诱导肿瘤相关免疫细胞耐受在HCC进程中的作用，以及深入阐明TGF-β诱导免疫细胞耐受的分子病理机制。方法：采用DEN灌胃的方法诱导大鼠肝癌模型。SD大鼠随机分为正常组和模型组。模型组大鼠灌胃给予DEN（0.1%DEN8mg/kg/次，每天1次，每周6天），正常组给予等量的生理盐水，共16周。分别于造模的第4周，第12周和第16周处死大鼠。HE染色观察肝组织病理学变化；流式细胞术检测大鼠外周血中DC表面CD80、CD86和MHCⅡ表达及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例；ELISA法检测大鼠肝组织中TGF-β水平。体外诱导培养小鼠骨髓来源DC，在DC培养d4，加入10ng/ml TGF-β刺激DC（TGF-β-DC）。采用流式细胞术及Western blot法分析DC表型及抗原摄取能力；以小鼠脾脏来源的T淋巴细胞作为反应细胞与DC进行混合淋巴细胞反应（MLR），MTT法检测DC刺激T细胞增殖的能力；ELISA法测定DC培养上清液中IL-10和IL-12水平。体外诱导培养小鼠骨髓来源DC，分别于培养的不同时间点、加入不同浓度的TGF-β刺激DC（TGF-β-DC）。采用流式细胞术及Western blot法检测DC中PD-L1、STAT3和p-STAT3表达；收集培养至6d的DC与小鼠脾脏来源的T淋巴细胞共培养48h，流式细胞术检测T细胞凋亡及CD4+CD25+Foxp3+Treg的生成情况；收集共培养后的T细胞与小鼠肝癌细胞（Hepa）共培养24h，MTT法检测T细胞对Hepa的杀伤率。结果:1DEN诱导大鼠HCC病程中，TGF-β水平、DC表型及CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的动态变化1.1DEN诱导大鼠肝脏病变正常大鼠肝脏红润，表面光滑有光泽；肝小叶结构清晰，肝索排列整齐。DEN诱导后，大鼠肝脏病变大致可分为3个时期：（1）炎症损伤期：在造模第4周，肝脏表面略失去光泽；肝细胞变性、肿胀，伴有不同程度的脂肪变及炎细胞浸润。（2）纤维化-硬化期：在造模第12周，肝脏颜色变浅，表面粗糙；肝小叶结构异常，被较粗大的纤维分割包绕，假小叶形成，逐渐呈肝硬化表现。（3）癌变期：在造模第16周，肝脏表面粗糙不平，出现大小不等的结节，癌肿形成；癌细胞浸润，细胞排列紊乱，异型性明显，细胞核增大，胞质减少。1.2大鼠肝脏癌变过程中TGF-β水平的变化在造模第4、12和16周，与正常组比较，模型组大鼠肝组织中TGF-β水平均升高，且随着病程进展，TGF-β水平逐渐升高。1.3大鼠肝脏癌变过程中DC表型的变化1.3.1大鼠肝脏癌变过程中DC表面CD80的表达在造模第4周，与正常组相比，模型组大鼠DC表面CD80表达增加，但无统计学意义；在造模第12、16周，与正常组相比，模型组大鼠DC表面CD80表达显著下降。1.3.2大鼠肝脏癌变过程中DC表面CD86的表达在造模第4周和12周，与正常组相比，模型组大鼠DC表面CD86的表达无明显变化。在造模第16周，与正常组相比，模型组大鼠DC表面CD86表达减少。1.3.3大鼠肝脏癌变过程中DC表面MHCⅡ的表达在造模第4周，与正常组比较，模型组大鼠DC表面MHCⅡ表达明显增加；在造模第12周，MHCⅡ表达无明显变化；在造模第16周，与正常组比较，模型组大鼠DC表面MHCⅡ表达显著减少。1.4大鼠肝脏癌变过程中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例的变化在造模第4、12和16周，与正常组比较，模型组大鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg比例显著增加，且随着病程进展，Treg比例逐渐增加。2TGF-β对DC表型和功能的影响2.1小鼠骨髓来源DC的鉴定1）形态学观察小鼠骨髓来源的单核细胞培养3-4h贴壁，经rmIL-4（10ng/ml）、rmGM-CSF(20ng/ml)诱导培养24h后，倒置相差显微镜下观察可见细胞贴壁生长，部分悬浮生长；培养2-3d后出现细胞集落，细胞体积明显增大，贴壁细胞逐渐减少，可见少量具有树突样突起的悬浮细胞。培养至5d时可见树突样悬浮细胞逐渐增多，培养至6d时，悬浮细胞大量聚集，表面突起伸长，为典型的树突状细胞。2）表型检测CD11c作为小鼠骨髓来源DC的特异性表面分子，证明小鼠骨髓来源的单个核细胞体经外诱导培养可获得较高纯度的DC。本研究结果显示，DC表面CD11c的表达量达(83.7±1.8)%。2.2TGF-β对DC表面CD40、CD83、CD86和MHCⅡ表达的影响与对照组DC相比，TGF-β-DC表面CD40、CD83、CD86和MHCⅡ表达明显下调。2.3TGF-β对DC中CD45RB和IDO表达的影响与对照组DC相比，TGF-β-DC中CD45RB表达增加，IDO表达也显著增加。2.4TGF-β对DC分泌IL-10和IL-12的影响为了进一步探讨TGF-β对DC免疫力的影响，我们采用ELISA法检测DC培养上清中IL-10和IL-12水平。结果显示，与对照组DC培养上清相比，TGF-β-DC上清液中IL-10水平明显升高，IL-12水平下降。2.5TGF-β对DC抗原摄取能力的影响培养6d的DC为未成熟DC（imDC），90min内对FITC-Dextran有较强的摄取率。TGF-β诱导后，DC对抗原的摄取能力增加。2.6TGF-β对DC刺激T细胞增殖功能的影响将培养6d的DC与小鼠脾脏来源的T淋巴细胞共培养48h，DC表现出较强的促进T细胞增殖能力。TGF-β诱导后，DC刺激T细胞增殖的能力显著下降。3TGF-β诱导Hepa免疫逃逸的分子机制3.1TGF-β上调DC表面PD-L1表达分别在DC培养的d3，d4和d5加入TGF-β（10ng/ml），d6流式细胞术检测其表面PD-L1的表达水平。结果显示，TGF-β上调了DC表面PD-L1表达。为了进一步观察TGF-β对DC表面PD-L1表达的影响，我们进行了浓度依赖性试验，即在DC培养的d4分别加入5ng/ml，10ng/ml和20ng/ml的TGF-β，d6流式细胞术检测其表面PD-L1的表达水平。结果显示，5ng/ml，10ng/ml和20ng/ml的TGF-β均能上调DC表面PD-L1的表达。3.2TGF-β上调DC中STAT3和p-STAT3表达STAT3广泛的表达于机体各组织细胞并且能被生长因子活化，因此我们也评价了TGF-β对DC中STAT3和p-STAT3表达的影响。结果显示，分别于DC培养的d3，d4和d5加入TGF-β（10ng/ml）均能上调其STAT3和p-STAT3的表达水平，尤其在d4。同时，我们进行了浓度依赖性试验，结果显示，5ng/ml，10ng/ml和20ng/ml的TGF-β均能上调DC中STAT3和p-STAT3表达。3.3STAT3特异性阻断剂NSC74859作用后，DC表面PD-L1表达的变化为了进一步探讨DC表面PD-L1表达的分子机制，我们进行了阻断性试验，即在DC培养的d4加入NSC74859（100μM），d6流式细胞术及Western blot法检测其表面PD-L1的表达水平。结果显示，与对照组DC相比，TGF-β-DC表面PD-L1表达增加，加入NSC74859后，PD-L1表达显著下降。3.4TGF-β-DC诱导T细胞凋亡流式结果显示，与对照组DC相比， TGF-β-DC（10ng/ml和20ng/ml TGF-β）诱导了T细胞凋亡。3.5TGF-β-DC诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg生成我们还观察了TGF-β-DC对诱导Treg生成的影响。结果显示，与对照组DC相比，TGF-β-DC（5ng/ml，10ng/ml和20ng/ml TGF-β）诱导了CD4+CD25+Foxp3+Treg生成。3.6TGF-β-DC抑制了T细胞对Hepa的杀伤作用DC作为体内功能最强大的APC，在T细胞介导的抗肿瘤免疫应答中发挥着十分重要的作用。以上结果提示TGF-β可通过PD-L1/PD-1通路诱导T细胞无能。因此，我们进一步观察了与TGF-β-DC共培养后的T细胞对小鼠肝癌细胞Hepa杀伤作用的变化。结果显示，与TGF-β-DC共培养后的T细胞对Hepa的杀伤作用明显减弱。结论：1. DEN诱导大鼠肝癌模型大致可分为3个时期：炎症损伤期（第4周）、纤维化-硬化期（第12周）和癌变期（第16周）。在这三个期，模型组大鼠TGF-β水平和Treg比例显著升高，且随着病程的进展不断升高；在炎症损伤期，模型组大鼠DC表面CD80和CD86表达无显著变化，MHCⅡ表达增加；在纤维化-硬化期和癌变期，模型组大鼠DC表面CD80，CD86和MHCⅡ的表达均显著下降。2. TGF-β下调DC表面共刺激分子（CD40、CD83、CD86和MHCⅡ）表达、上调DC中免疫抑制性分子（CD45RB、IDO和PD-L1）表达、抑制DC活化T细胞能力、诱导T细胞凋亡和Treg生成以及抑制T细胞对Hepa的杀伤作用。3. TGF-β主要通过STAT3相关信号通路上调DC表面PD-L1表达，TGF-β-STAT3-PD-L1信号通路为基于DC的肿瘤免疫学疗法提供了新靶标。