氯虫苯甲酰胺对东方粘虫的毒力测定及GST家族鉴定

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东方粘虫Mythimna separata(Walker)(鳞翅目:夜蛾科),简称粘虫,是一种世界范围分布的杂食性迁飞害虫,主要危害小麦和玉米等粮食作物。氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole,CAP)是一种双酰胺类杀虫剂,其作用靶标是昆虫的鱼尼丁受体,常用于防治包括粘虫在内的许多农业害虫。目前粘虫已经对氯虫苯甲酰胺等杀虫剂产生了不同程度的抗药性,而靶标位点的突变和解毒代谢的增强是产生抗药性的主要原因。谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)是一类重要的解毒酶,与杀虫剂抗性有密切关系。然而,目前关于粘虫GST超家族及其参与CAP代谢的研究很少,本论文中主要开展了以下研究:1.氯虫苯甲酰胺对粘虫幼虫的毒性作用。分析了CAP对粘虫幼虫的胃毒毒性:粘虫喂食不同剂量的CAP后,观察体重变化,绘制生存曲线并测定LC50,制作中肠病理切片进行观察。结果表明:亚致死浓度下粘虫幼虫生长的较快,致死浓度下,粘虫完全停止生长。24h、48h和72 h后,LC50分别为17.615 mg/L、3.127 mg/L和1.336 mg/L。中毒的幼虫体节收缩,中肠细胞异常,肌肉解离。2.CAT、SOD和GST的酶活性分析。处理组饲喂2或4 mg/L CAP,收集组织匀浆进行全虫酶活性测定。CAT(过氧化氢酶)、SOD(超氧化物歧化酶)和GST的活性在CAP刺激后的不同时间点升高。结果显示:在6 h,三种酶在对照组和2 mg/L CAP之间的酶活性没有差异。然而,在4 mg/L CAP处理下,CAT和SOD活性增加,GST活性降低。24 h后,对照组和处理组之间CAT活性没有变化,而在4 mg/L处理后SOD活性降低。经4 mg/L CAP处理后24 h,GST活性显著增加。3.转录组测序、基因注释和差异表达基因分析。构建了六个粘虫幼虫文库(3个对照组和3个CAP处理)用于转录组测序。通过从头组装,共获得平均长度为1010bp的43055个unigene,在GO、KEGG、COG、NR、Swiss Prot和Pfam数据库中成功注释了22197个unigene(51.55%)。发现了567个上调和692个下调的差异表达基因(DEG)。4.粘虫GST超家族的鉴定及系统发育分析。从unigene中鉴定出了35个GST基因(MseGST)。以幼虫cDNA为模板扩增35个GST基因并进行了测序。使用昆虫GST的氨基酸构建了系统发育树(NJ法),35个GST分布在除Theta外的7个进化分支中,共包括31个胞质、3个微粒体和1个未分类型GST。胞质型中包括4个Delta、16个Epsilon、3个Omega、7个Sigma和1个Zeta型。5.GST基因表达谱分析。对GST基因在粘虫不同发育期、成虫各组织和CAP诱导后幼虫中的表达谱进行了q PCR分析。结果显示某些GST基因在不同的发育期和成虫组织中呈现出显著的高水平表达。例如,MseGSTd1主要表达于雄性触角和雌性触角,MseGSTd2和Mse GSTd4在腹部高表达,而Mse GSTd3在头部高表达。幼虫经2 mg/L CAP处理6 h后,28个GST基因显著上调,而经2 mg/L处理6 h或2 mg/L和4 mg/L处理24 h后大部分GST基因显著下调。6.重组蛋白对CAP的体外代谢分析。对表达纯化的MseGSTe2和MseGSTs6重组蛋白进行了酶动力学分析。通过高效液相色谱(HPLC)进行体外代谢实验,结果显示这两个重组蛋白均能够代谢CAP。本论文探究了CAP对粘虫的胃毒毒性,鉴定了粘虫的GST超家族,并初步探索了GST重组蛋白对CAP的代谢作用。本研究为后续深入分析粘虫GST家族参与解毒代谢的作用机制,指导农药的合理使用,促进粘虫的绿色防治提供了理论支持。
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