梨糖转运蛋白基因家族分析及PbtMT4和PbSWEET基因功能研究

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糖分的合成与积累是影响果实品质和商品价值的核心因素,也是遗传育种和基础理论研究者普遍关注的科学问题。由于果实糖的合成代谢途径复杂,涉及长距离、跨膜运输,并受多基因协同调控,导致对其作用机制研究难度较大。目前,研究更多的集中在果实糖的合成,对其转运调控的机制研究比较少。因此,本研究通过基因组、转录组、蛋白质组以及转基因等研究手段,重点开展了梨果实糖转运蛋白基因家族鉴定和功能分析,研究结果如下:1、在砀山酥梨梨果实三个重要发育时期[15盛花后天数(DAFB);80 DAFB;145 DAFB]中共鉴定到1810个蛋白。蛋白质组与转录组关联分析结果表明,分别有1724,1722以及1718个蛋白在这三个时期在蛋白质组与转录组水平上均检测到表达。其中,237,318 以及 425 个蛋白在 15 DAFB vs 40 DAFB,40 DAFB vs 145 DAFB 以及15 DAFB vs 145 DAFB的对比中鉴定为差异表达蛋白。通过与转录组相关性分析结果发现,差异蛋白的表达水平与转录组水平的相关系数分别为0.6336,0.4113和0.7049。最终,共鉴定到35个果实品质相关的重要差异表达蛋白,包含了 3个糖合成与转运相关的蛋白质。2、在梨中共鉴定到75个糖转运蛋白(ST)成员。根据系统发育进化树及保守结构域分析结果,梨所有的ST被分成8个亚家族,并发现ST上游区域包含MYBCOREATCYCB1启动子顺式元件,但该启动子在仅存在于葡萄中蔗糖转运蛋白的启动子区域。全基因组复制(WGD)和片段复制是ST家族扩张的主要推动力,串联复制次之。ST旁系同源基因的正选择位点分析表明,所有pGlcT亚家族成员均经历正选择。此外,在第二次WGD后,尤其在苹果与梨的分化后,整个ST家族经历了显著的扩张。根据梨果实动态发育的转录组测序结果,发现53个ST可检测到基因表达。结合实时荧光定量检测,发现3个PbtMT(PbtMT2、PbtMT3、PbtMT4)和2个PbPLT(PbPLT9、PbPLT22)是果实发育与成熟涉及糖积累过程的候选基因。在此基础上,对PbtMT4基因进行克隆和功能分析,发现该基因定位在液泡膜上,并对植株的生长发育具有促进作用,对果实糖分积累也具有增强效应,且在梨果实中过表达PbtMT4后对PbtMT基因家族的其他成员具有不同程度的显著上调,表明该基因家族的表达可能受到糖分的影响。3、在梨中共鉴定定到18个PbSWEET糖转运蛋白基因家族成员,系统进化树分析表明,该基因家族可分成4个分支。在6个物种中SWEET基因家族的结构均非常保守。PbSWEET转运蛋白包含7个跨膜区域,该结构是由一个古老的3个横跨膜片段(TMS)单元通过内部复制且由第四个TMS连接而来。WGD/片段复制和分散复制是SWEET家族在6个物种(梨、苹果、桃、森林草莓、梅以及拟南芥)中进化的主要推动力,其中WGD在梨中起主要作用。结合基因表达分析发现,PbSWEET15和PbSWEET17在任何组织中都不表达,推测其是假基因,并且PbSWEET复制基因对中的62.5%存在功能分化;PbSWEET6,PbSWEET7和PbSWEET14在叶片的糖转运过程中起重要作用;PbSWEET1和PbSWEET2的高表达促进了糖从茎的韧皮部卸载;PbSWEET5,PbSWEET9和PbSWEET10可能促进花粉的发育。通过对部分PbSWEET基因家族基因功能初步鉴定,发现PbSWEET10和PbSWEET11可使酵母突变体(EBY-4000)菌株在含有葡萄糖的筛选养基恢复生长,说明这两个基因可以促进葡萄糖运输。通过亚细胞定位发现,PbSWEET基因成员主要定位在细胞质膜上,而PbSWEET3定位在液泡膜上,表明其主要在细胞膜上行使功能。
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