蜂毒，包括蜜蜂蜂毒(honeybee venom)和胡蜂蜂毒(vespid venom)，是古今中外应用广泛的天然药物，具有重要的开发利用价值。蜂毒明肽(apamin)、镇静肽(secapin)和肥大细胞脱粒肽(MCDP)是蜜蜂蜂毒的3个主要的多肽，在医学、分子生物学研究等方面均具有重要的研究开发利用价值；蜂毒过敏原抗原5(allergen antigen5，Ag5)是胡蜂蜂毒的主要过敏原之一，在蜂毒的过敏诊断和治疗上有重要的应用价值。目前，我国所开展的蜜蜂蜂毒分子生物学研究不多，而胡蜂蜂毒的研究又几近空白。本论文开展了蜂毒明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽和过敏原抗原5基因的克隆与表达研究，首次证明了胡蜂总科存在与蜜蜂相似的明肽、镇静肽、肥大细胞脱粒肽基因，并同时将它们在大肠杆菌和昆虫细胞中进行了表达；同时，我们还首次克隆到了额班黄胡蜂过敏原抗原5基因，并将其在原核和真核两个表达系统中进行了高效表达。本文是国内首次开展的胡蜂蜂毒的分子生物学研究。 主要结果包括下列四个部分： 1．蜂毒明肽基因的克隆与表达 (1)用RT-PCR方法克隆了中华蜜蜂、意大利蜜蜂、大胡蜂、墨胸胡蜂、额班黄胡蜂和亚非马蜂蜂毒前明肽原基因的编码区，序列全长均为141 bp，这6种蜂的前明肽原都是由46个氨基酸残基组成，预测的分子量都为5.1kD。根据氨基酸联配结果，6种蜂的前明肽原可分为两种类型，而6种蜂的明肽是完全保守的。利用3’RACE方法克隆到了中蜂明肽3’非编码区的162bp序列，与意蜂的相应序列有91.4％的同源性，主要的变化是中蜂在226bp处分别有1bp的插入，而在236和237bp位置则有2bp的缺失。 (2)将中华蜜蜂前明肽原与3’非编码区部分序列和成熟肽与3’非编码区部分克隆，分别构建了前明肽原与谷胱甘肽转移酶(GST)和明肽与GST融合表达载体pGEX／AccPPapamin和pGEX／AccApamin。将载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)进 浙江大学博士学位论文行融合表达。两者的表达产物经 SDS－PAGE分析，分别在 28kD和 3 IkD处产生特异性的表达条带，均与预期分子量大小一致；以抗GST抗体的Western印迹分析也证实了中蜂明肽和前明肽原的表达产物在 28th和 3IkD处有很强的交叉反应，表明中蜂明肽和前明肽原与GST融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达。明肽与GST融合蛋白的表达产物约占总蛋白的 3 0％，通过表达条件的优化，表达的目的蛋白多为可溶性融合蛋白。通过GST亲和层析柱回收和凝血酶的切割，得到了中蜂明肽蛋白。 （3）应用Bac－to－Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞中快速表达了中蜂明肽与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的约34to的融合蛋白，表达的特异性蛋白（表达量）占Tn细胞总蛋白的 10．9％。以鼠抗 His抗体作 Western印迹分析，发现表达产物在约 34kD处有明显的阳性条带，与预期目的蛋白分子量大小一致。二．蜂毒镇静肽基因的克隆与表达 （l）用 RT－PCR方法克隆了中华蜜蜂、意大利蜜蜂。大胡蜂、墨胸胡蜂、额斑黄胡蜂和亚非马蜂蜂毒前镇静肽原基因的编码区序列，全长均为234 hP，这6种蜂的前镇静肽原都是由77个氨基酸残基组成，预测的分子量都为8．skD。根据氨基酸联配结果，意蜂杭州种群、墨胸胡蜂、大胡蜂、亚非马蜂、中蜂和额斑黄胡蜂与欧洲意蜂前镇静肽原同源性分别为97％、96％、93％、93％、85％和85％；亲缘关系不同的6种蜂彼此之间的同源性都大于85％。从代表成熟肽（镇静肽）的最后25个氨基酸序列看，亲缘关系不同的6种蜂的镇静肽可以分为三种类型，意蜂（杭州和欧洲种群）、大胡蜂和墨胸胡蜂为第一种类型，亚非马蜂为第二种类型，中蜂和额斑黄胡蜂为第三种类型。从6种蜂前镇静肽原氨基酸序列所作的进化树可见墨胸胡蜂、意蜂（欧洲与杭州种群）、大胡蜂和亚非马蜂前镇静肽原同处一个分枝中，中蜂与额斑黄胡蜂处在另一个分枝中。中蜂与额斑黄胡蜂，墨胸胡蜂与意蜂（欧洲与杭州种群）前镇静肽原的同源性最高。6种蜂的蜂毒前镇静肽原的亲缘关系与这6种蜂的亲缘关系并不完全一致。 u）以 3’RACE方法，扩增和测定了中蜂镇静肽基因 3’端非编码区 219 hp序列。3端非编码区 CDNA序列与欧洲意蜂序列有刀．1％同源性。将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与3’非编码区部分克隆，构建了镇静肽与GST 融合表达的载体pGEX／Accsecapin。将载体转化大肠杆菌 BLZI（DE3）进行融合表达。表达产物与抗GST抗体在29kD处有很强的交叉反应。镇静肽与GST融合蛋臼的表达产物约占总蛋 且互 q 浙江大学博士学位论文白的30％，通过优化表达条件，表达的目的蛋白多为可溶性融合蛋白。通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白。本研究是首次通过重组技术获得了仅3刀kD的中蜂蜂毒镇静肽。 （）应用 Bac－to习ac杆状病毒表达系统在昆虫细胞?