在成体可兴奋细胞如骨骼肌细胞,膜电位及膜极化状态的改变是细胞兴奋/收缩偶联的重要基础。膜电位也和细胞的增殖能力存在相关性,增殖细胞的膜电位较低,氯离子是维持和调节膜电位最重要的阴离子。目前已发现多种氯通道,包括 C1C-1、CFTR、ClC-2、ClC-3、Bestrophines、TMEM16A、TMEM16B等。我们之前的研究提示,TMEM16A可能是小鼠骨骼肌发育过程中细胞膜去极化的关键调节分子。TMEM16A(Transmembrane protein 16A,又称 Anol)是第一个被发现的钙依赖的氯通道(Calcium activated chloride channels,CaCCs)分子,广泛表达于从爪蟾到人体的各种组织细胞,介导细胞内Cl-的外流,导致细胞去极化。为了探索TMEM16A对于骨骼肌发育的调节作用,本文首先采用MTT法研究了 TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01(IC50=1.8μM)对于肌母细胞C2C12增殖的调节。结果发现,T16Ainh-A01处理C2C12细胞的增殖明显高于对照细胞(平均增加25.1%)。进一步应用EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)摄入分析发现,T16Ainh-A01处理细胞的EdU摄入水平显著高于对照组。分离骨骼肌原代肌母细胞,观察得到相似的作用。在体外诱导C2C12细胞分化的研究中发现,T16Ainh-A01在20μM时,已明显抑制肌母细胞的分化,肌管比对照组肌管细且短小,分化指数也低于对照组(核融合指数减少45.8%,肌纤维长度减少42.3%,肌纤维直径减少31.6%)。而泛氯通道抑制剂NFA(IC50=7.2μM)对于C2C12细胞分化的抑制作用明显较T16Ainh-A0I弱。以上研究结果提示,TMEM16A可能通过抑制肌母细胞增殖,促进肌母细胞分化调节骨骼肌的分化发育。在过表达TMEM6A的C2C12细胞中,我们还初步发现,其p-ERK1/2水平明显高于对照组,推测与其促进肌肉分化功能相关。我们之前还观察到TMEM16A在小鼠成体骨骼肌中大量表达,那么其功能是什么?本文进一步研究了 TMEM16A在骨骼肌中的表达与分布特征。通过免疫荧光和Western Blotting分析发现,小鼠出生后,从第5周到第9周,TMEM16A从主要分布于细胞质中逐渐转移到主要分布于细胞膜上;而在快慢混合肌TA(胫骨前肌)中,TMEM16A表达量明显比快肌QUA(股四头肌)中多。由于快肌纤维和慢肌纤维的重要区别是后者含线粒体较前者多,因此我们猜测TMEM16A在胞质中可能定位于线粒体。但通过提取骨骼肌亚细胞成分和Western Blotting分析发现TMEM16A在线粒体并没有明显分布。综上所述,本文的研究结果表明,钙离子依赖的氯通道TMEM16A特异性抑制剂T16Ainh-A01可促进肌母细胞增殖,抑制其肌分化,提示TMEM6A介导的细胞膜内外氯离子流动及细胞膜电位的改变在骨骼肌分化发育中具有关键调节作用;TMEM6A在不同发育时期在骨骼肌纤维上的不同分布特征及其在快慢肌中的表达水平差异,提示其在骨骼肌中可能具有多种功能。