【研究背景】肝纤维化是由于机体对各种慢性肝损伤的主动组织修复而导致细胞外基质在肝脏内过度沉积的病理过程，是多数慢性肝病共有的病理特征，也是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经过程，其形成与发展已经成为影响诸多肝病预后、转归的关键。因此，有效地阻断肝纤维化的发展，对防治肝硬化具有重要意义。肝纤维化进程的启动与肝损伤而引发的炎症反应密切关联，肝脏炎症时肝脏驻留巨噬细胞Kupffer细胞的激活以及肝星状细胞（hepaticstellatecell,HSC）的活化、增殖和转化是肝纤维化形成的重要细胞学基础。基于此，肝纤维化的发生机制和防治药物的研究长期以来主要聚焦于肝Kupffer细胞和HSC。最近的研究发现：在炎症状况下，从外周血迁移至肝脏的单核细胞也参与了肝纤维化的进程，而这些炎性浸润的单核细胞向肝脏募集的分子机制也逐渐被阐明。血液来源的单核细胞是肝脏巨噬细胞的前体，分为Gr1^high和Gr1low两种亚型，其中只有Gr1^high单核细胞高表达C-C类趋化因子受体CCR2。肝组织损伤导致肝内高表达CCR2的配体—单核细胞趋化蛋白-1（monocytechemotacticprotein-1,MCP-1），在其作用下，Gr1^high单核细胞从骨髓释放入血并被选择性地大量募集至肝脏损伤部位，激活Kupffer细胞和HSC，启动并促进纤维化的进程。这一新发现不仅扩展了我们对肝纤维化进程中关键性的细胞和分子事件的认识，也为肝纤维化的防治提供了一种新的药物干预靶点。苦参碱（matrine，Mat）是苦参中生物碱类的主要有效成分，具有广泛的药理活性，国内临床使用Mat制剂治疗急慢性肝炎已取得良好疗效，在各种肝炎和肝纤维化动物模型上，Mat亦显示一定的抗肝炎和抗纤维化效应。但是Mat的具体作用机制尚未完全阐明，且其药理活性不高。为了研发活性更强的候选药物，近年来本课题组开展了对Mat的结构改造和结构改造衍生物的药理活性筛选工作，发现了一种体外抗炎活性和体内抗肝纤维化效应均明显优于Mat的新化合物M19，并发现M19具有强于Mat的抑制肝星状细胞的活化、增殖和合成胶原的药理活性。鉴于最近的研究新发现炎症状况下迁移至肝脏的Gr1^high单核细胞在肝纤维化发展中具有关键性促进作用，本课题进一步分析了Mat和M19的抗肝炎和抗肝纤维化作用和作用机制，重点比较了它们对Gr1^high单核细胞向肝脏浸润的影响，并探讨了相关的作用机制。【研究目的】进一步探讨与Mat和M19抗肝炎和抗肝纤维化的效应相关的作用机制，尤其是与Gr1^high单核细胞向肝脏浸润的关系，为进一步研发新型的抗肝炎和抗肝纤维化药物奠定基础。【研究方法】1.Mat和M19的抗肝炎作用研究：C57BL/6小鼠单次腹腔注射CCl4（0.6ml/kg）造成急性肝损伤模型，Mat和M19（30mg/kg）分别于CCl4注射前3小时灌胃给药。通过检测各实验组血清的谷丙转氨酶（ALT）水平和肝组织的病理分析，评价药物的抗肝炎效应。2.Mat和M19影响Gr1^high单核细胞向肝脏浸润的研究：采用CCl4诱导的急性肝损伤模型，分离正常对照组、模型组和给药组肝脏的非实质细胞，用各种细胞表面标志性的荧光标记抗体标记后，用流式细胞仪检测非实质细胞中各种炎症细胞和免疫细胞亚群的比例和数目，分析药物对Gr1^high单核细胞肝脏浸润作用的影响，并使用抗CD11b抗体进行肝组织免疫组化分析，检测各实验组小鼠肝脏CD11b阳性的单核细胞浸润的情况。3.Mat和M19影响Gr1^high单核细胞肝脏浸润的机制研究：通过检测药物对特异性介导Gr1^high单核细胞向肝脏迁移的趋化因子MCP-1的产生及其趋化活性的影响，分析Mat和M19影响Gr1^high单核细胞肝脏浸润的作用机制。体内实验采用CCl4诱导的急性肝损伤模型，用ELISA法检测各实验组小鼠血清的MCP-1水平，用Real-timePCR法检测实验组小鼠肝组织MCP-1mRNA的水平，采用免疫组化的分析方法检测小鼠肝组织MCP-1的蛋白表达水平。体外实验分别采用内毒素（LPS）刺激的小鼠肝脏非实质细胞分泌MCP-1及其上游诱导因子TNF-α，以及TNF-α刺激的小鼠肝星状细胞表达MCP-1为细胞模型，检测药物对MCP-1产生的影响。采用Transwell实验检测药物对MCP-1趋化活性的影响。4.Mat和M19的抗肝纤维化效应及其抑制慢性炎症状况下Gr1^high单核细胞肝脏浸润作用研究：C57BL/6小鼠多次（每周2次，共6周）腹腔注射CCl4（0.6ml/kg）造成慢性肝炎模型，Mat和M19分别于第1周开始灌胃给药（30mg/kg,每周连续5次），第6周末取各实验组小鼠肝脏，通过病理分析肝脏胶原沉积并检测肝脏中羟脯氨酸含量评价肝纤维化程度；分离肝脏的非实质细胞，以各种细胞表面标志的荧光标记抗体标记后用流式细胞仪检测非实质细胞中单核细胞亚群的比例和数目，分析苦参碱和M19对CCl4反复刺激诱导的纤维化肝脏内白细胞和Gr1^high单核细胞浸润的影响；采用Real-timePCR法检测实验组小鼠肝组织MCP-1mRNA的水平，分析药物对MCP-1表达的影响，探讨药物影响Gr1^high单核细胞肝脏浸润的作用机制。【研究结果】1.Mat和M19对CCl4诱导的急性肝损伤具有保护作用。CCl4单次腹腔注射可造成小鼠的急性肝损伤，表现在CCl4注射通过后6h血清ALT水平开始显著升高，24h时达最峰，48h后逐渐降低；肝组织病理分析24h时肝细胞损伤最为严重，并伴有大量炎性细胞浸润。Mat和M19治疗可以显著降低血清ALT水平，并明显减轻小鼠肝细胞损伤，明显减少肝内炎性细胞浸润说明Mat和M19对CCl4诱导的急性肝损伤具有抗炎和保护作用。2.Mat和M19能够阻止Gr1^high单核细胞向急性炎症肝脏浸润。CCl4单次腹腔注射24h后，肝脏非实质细胞总数明显增加，而且CD45+白细胞的百分比和绝对细胞数目均明显增加，而在增加的CD45+白细胞中，只有CD11b+F4/80+Gr1^high单核细胞的百分比明显增加，CD3+T细胞的百分比有所降低(可能是由于CD11b+F4/80+Gr1^high单核细胞的百分比明显增加所致)，而其他类型细胞的百分率变化不明显；进一步比较各类白细胞亚群在肝内的细胞总数，发现与正常小鼠比较，CCl4注射组肝内CD11b和F4/80双阳性的Gr1^high单核细胞增加最为明显，其他亚群细胞数目的变化均不显著。这一结果表明CCl4诱导的急性肝损伤主要导致外周血中的Gr1^high单核细胞向肝脏浸润。进一步检测正常对照组，CCl4急性肝损伤模型组，Mat给药组和M19给药组等4个实验组小鼠肝脏非实质细胞中的白细胞和单核细胞百分比和细胞总数，发现Mat和M19给药可使肝脏中非实质细胞总数及其中的CD45+淋巴细胞百分比和数目均明显减少，进一步分析不同单核细胞亚群的百分比和数目，发现药物治疗能够导致Gr1^high单核细胞的比例和数目较模型组显著减少，而且M19给药组减少得最为明显。而对Gr1low单核细胞的比例和数目的影响不大。免疫组化分析结果表明模型组CD11b阳性细胞在肝组织损伤区域大量浸润，给药组单核细胞浸润明显减少，说明药物治疗可以明显抑制CD11b阳性的单核细胞向肝内浸润。这些结果表明Mat和M19能够阻止Gr1^high单核细胞向急性炎症肝脏浸润。3.Mat和M19通过抑制MCP-1的生产和趋化活性阻止Gr1^high单核细胞向肝脏迁移。Mat和M19体内给药可以显著降低血清的MCP-1水平，下调肝组织内MCP-1的mRNA和蛋白水平，而且M19的药理作用强于Mat；体外实验中，M19在5-50μM剂量范围内能够剂量依赖性地抑制LPS刺激的肝脏非实质细胞分泌MCP-1和TNF-α，并抑制TNF-α刺激的肝脏星状细胞表达MCP-1；Mat仅在较高剂量（100μM）时显著抑制LPS刺激的肝脏非实质细胞分泌MCP-1，并抑制TNF-α刺激的肝脏星状细胞表达MCP-1。Transwell实验结果表明：Mat和M19可以在5-20μM剂量范围内剂量依赖性地减少MCP-1刺激的PMBC的迁移，M19的抑制作用强于Mat。上述结果表明Mat和M19可以通过对MCP-1的生产和趋化活性的双重抑制作用阻止Gr1^high单核细胞向肝脏迁移，而且M19的上述药理活性强于Mat。4.Mat和M19对CCl4反复刺激诱导的Gr1^high单核细胞肝脏浸润也具有抑制作用并显示抗肝纤维化效应。在采用多次腹腔注射CCl4造成的慢性肝炎模型体内实验中，Mat和M19整体给药可以显著减少肝脏内淋巴细胞的数量，尤其是Gr1^high单核细胞的数量，同时减少肝组织胶原的沉积和肝脏中羟脯氨酸的含量，并下调肝组织MCP-1的表达，而且M19的上述药理活性均明显强于Mat。这些结果表明，在CCl4反复刺激造成慢性肝炎的情况下，Mat和M19亦能通过抑制MCP-1的生产，阻止Gr1^high单核细胞向肝脏浸润，进而发挥抗肝纤维化效应。【结论】Mat和M19通过降低肝脏内MCP-1的表达并抑制MCP-1的趋化活性，阻止急性和慢性肝脏炎症时Gr1^high单核细胞向肝脏的迁移，从而发挥抗肝炎和抗肝纤维化的效应，Mat的结构改造衍生物M19的药理活性强于Mat。本研究进一步拓展了我们对Mat和M19抗肝炎和抗肝纤维化作用机制的认识，并为进一步研发效应更强的抗炎和抗纤维化新药奠定了基础。