研究背景慢性肝病严重危害着人类的健康。病毒性肝炎、酒精、药物、自身免疫性肝病等十多种因素引起的慢性肝病均可导致机体产生对损伤的一种代偿性修复反应,发生肝纤维化(HF)。针对肝纤维化发病机制的研究,有助于早期发现并诊断肝纤维化。不同的损伤因素作用于肝脏后,肝纤维化发生的病理生理过程、参与的细胞因子存在不同程度差异,但是肝星状细胞(HSC)活化、细胞外基质(ECM)沉积,最终导致肝脏纤维化发生是其共同病理生理过程。因此,采用不同病因致肝纤维化动物模型进行研究有助于从不同角度阐明早期肝纤维化的发病机制。肝脏ECM的合成和降解由基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)共同调节。损伤因素作用于肝脏后可导致HSC活化,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),MMPs表达上调,TIMPs也随之上调,导致了不同MMPs/TIMPs动态表达的比例失衡,以I型胶原为主的ECM的合成和降解也随之失衡,过量沉积在肝内,促进了肝纤维化及肝硬化的形成。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPr Pl),是导师课题组十余年来在国家自然科学基金资助下发现的新的致肝纤维化因子并对其致肝纤维化的机制做了大量研究工作。IGFBPr Pl在致肝纤维化过程中,对HSC活化及ECM的合成、降解、重塑发挥着重要的作用。转化生长因子β1(TGFβ1)是目前公认的最强效的致肝纤维化细胞因子,IGFBPr P1与TGFβ1相互作用,相互影响,二者共同作用促进了肝纤维化的发生发展。那么,IGFBPr P1是否通过调节MMPs/TIMPs平衡致ECM沉积?目前国内外尚未见相关报道。Hedgehog(Hh)信号转导通路是参与早期发育的经典通路之一,控制着细胞的生长与增殖,可能在肝纤维化中起调控作用。导师课题组前期运用PCR Array筛选IGFBPr P1致肝纤维化的信号转导通路差异表达基因后发现,IGFBPr P1可以通过Hh通路导致肝脏HSC活化,ECM增多,促进肝纤维化发生发展。那么,肝脏IGFBPr P1、MMPs/TIMPs平衡与Hh信号通路三者之间的调节关系如何,目前国内外尚未见相关报道。为此,本课题拟深入研究IGFBPr Pl致肝纤维化发生发展过程中,是否通过调节MMPs/TIMPs平衡发挥作用,探索IGFBPr Pl对MMPs/TIMPs平衡的调节与Hh信号通路的关系。第一部分IGFBPr P1及MMPs/TIMPs平衡在小鼠肝纤维化组织中的动态变化及意义实验一TAA或BDL致小鼠肝纤维化过程中IGFBPr P1及MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1的动态表达变化目的:观察硫代乙酰胺(TAA)致小鼠肝纤维化或胆总管结扎(BDL)致小鼠肝纤维化形成过程中,IGFBPr P1以及MMPs/TIMPs平衡的动态变化。方法:(1)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为三组:正常组:正常饲养;对照组:腹腔注射生理盐水0.1ml/10g,每周3次;TAA组:腹腔注射TAA 100mg/Kg,每周3次。不同时间点(2w、4w、6w)麻醉动物后留取血清及肝组织样本,观察肝脏病理学改变,检测血清学指标,免疫组化及western blot方法检测肝组织IGFBPr P1、α-SMA、TGFβ1、MMPs、TIMPs等蛋白表达,Pearson相关分析肝组织中IGFBPr P1与MMPs、TIMPs蛋白表达的相关性。(2)C57BL/6野生型小鼠78只随机分为三组:正常组:正常饲养;对照组:仅分离胆总管;BDL组:实施BDL术。标本采集及检测同(1)。结果:(1)血清肝功能指标:TAA作用于小鼠2w,血清ALT、AST、LDH水平明显升高,4w、6w逐渐下降(P<0.05)。小鼠实施BDL后2w,血清ALT、AST水平明显升高,4w、6w逐渐下降(P<0.05);小鼠实施BDL后,随着病变发展,ALP及DBIL/TBIL比值逐渐增高(P<0.05);BDL后2w,血清GGT、LDH、TBIL水平明显升高,4w达到高峰,6w逐渐下降(P<0.05)。(2)肝组织HE和Sirius red染色:TAA作用于小鼠后,随着病变进展,大量炎细胞浸润,肝细胞变性坏死,纤维组织增生,形成肝纤维化。小鼠实施BDL后,随着病变进展,汇管区扩大,胆管扩张,炎性细胞浸润,大量小胆管增生,胶原纤维沉积,形成肝纤维化。(3)ELISA、免疫组化及western blot方法检测血清和肝脏中IGFBPr P1等蛋白表达:TAA或BDL作用于小鼠后,血清及肝脏IGFBPr P1表达随着肝纤维化程度加重逐渐升高(P<0.05),肝脏α-SMA、TGFβ1、CollagenⅠ在肝纤维化过程中表达逐渐增多(P<0.05)。(4)免疫组化及western blot方法检测肝脏中MMPs、TIMPs的表达:分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达,TAA作用于小鼠后,MMP2/TIMP2比值在2w组无变化,4w及6w组比值增高(P<0.05);各时间点MMP9/TIMP1比值显著降低(P<0.05)。小鼠实施BDL后,MMP2/TIMP2比值在2w、6w组下降(P<0.05),4w组无变化;各时间点MMP9/TIMP1比值显著降低(P<0.05)。(5)肝组织中IGFBPr P1与MMPs、TIMPs蛋白表达的相关性:在TAA作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1的相关系数分别为r=0.891,0.931,0.954,0.965,P<0.01,呈正相关关系。在BDL作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1的相关系数分别为r=0.930,0.941,0.914,0.946,P<0.01,呈正相关关系。结论:TAA或BDL作用于小鼠不同时间后,可使HSC活化、IGFBPr Pl及TGFβ1的表达上调、MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1的表达失衡,最终形成不同程度的肝纤维化第二部分IGFBPr P1过表达致小鼠肝纤维化形成中对MMPs/TIMPs平衡的调节实验二Ad IGFBPr P1基因转染致小鼠肝纤维化及其对MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡的调节目的:观察Ad IGFBPr P1基因转染致小鼠肝纤维化过程中,MMPs/TIMPs平衡的变化,明确肝脏IGFBPr P1与MMPs/TIMPs的关系及意义。方法:C57BL/6野生型小鼠135只随机分为三组:正常组:正常饲养;CAd组:尾静脉注射CAd 2×109pfu/只;Ad IGFBPr P1组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1 2×109pfu/只。分别于不同时间点(1w、2w、4w、8w、12w)标本采集及检测,检测方法同实验一。结果:(1)荧光显微镜EGFP表达:腺病毒转染1 w,肝组织可见绿色荧光,转染2 w时,可见明亮绿色荧光,EGFP表达明显增多,4w时绿色荧光逐渐减弱甚至消失。(2)血清肝功能指标:Ad IGFBPr P1转染小鼠1w后,ALT、AST迅速升高,后期逐渐下降(P<0.05);LDH在2w达高峰(P<0.05),后降至正常。(3)肝组织HE和Sirius red染色:Ad IGFBPr P1转染小鼠后,随着病变不断进展,大量炎细胞浸润,胶原纤维增生,肝细胞变性坏死,肝小叶结构遭到破坏,形成肝纤维化。(4)ELISA、免疫组化及western blot方法检测血清和肝脏中IGFBPr P1等蛋白的表达:Ad IGFBPr P1转染小鼠后,血清及肝组织中IGFBPr P1开始升高,2w达高峰(P<0.05)。肝脏α-SMA、TGFβ1、CollagenⅠ在肝纤维化过程中表达逐渐增多(P<0.05)。(5)免疫组化及western blot方法检测肝脏中MMPs、TIMPs的表达:Ad IGFBPr P1转染小鼠后,分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达后,各时间点MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1比值均降低(P<0.05)。结论:IGFBPr P1基因通过腺病毒转染至小鼠肝组织,导致了肝纤维化的发生,其作用可能与HSC的活化、TGFβ1表达上调、MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1表达失衡有关。第三部分下调IGFBPr P1对肝纤维形成中MMPs/TIMPs平衡的影响实验三Sh RNA-IGFBPr P1的构建及其细胞水平对MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡的影响目的:构建并筛选干扰效率最高的sh RNA-IGFBPr P1质粒,探讨下调NIH/3T3细胞中IGFBPr P1的表达是否通过逆转MMPs/TIMPs平衡来减少ECM的产生。方法:(1)构建三条sh RNA-IGFBPr P1干扰质粒及一条空载体质粒,分别转染NIH/3T3细胞,筛选干扰效率最高的sh RNA-IGFBPr P1质粒。(2)分别将干扰效率最高的质粒和空质粒转染NIH/3T3细胞,于24h、48h、72h、96h后收取细胞样品,实时荧光定量PCR及western blot方法检测肝组织α-SMA、TGFβ1、MMPs、TIMPs m RNA及蛋白表达和平衡变化。结果:(1)荧光定量PCR及western blot检测IGFBPr P1 m RNA及蛋白表达:与对照组及空质粒组相比,转染72h,各质粒对IGFBPr P1 m RNA及蛋白表达呈不同程度的抑制,其中以sh RNA-IGFBPr P1-1的抑制率最高(P<0.05)。(2)荧光定量PCR及western blot检测α-SMA等m RNA及蛋白表达:转染sh RNA-IGFBPr P1后,各时间点TGFβ1、α-SMA、Fibronectin m RNA及蛋白表达量均下降(P<0.05)。(3)荧光定量PCR及western blot检测MMPs、TIMPs m RNA及蛋白表达:转染sh RNA-IGFBPr P1后,分析各时间点的MMPs、TIMPs m RNA及蛋白表达后,MMP2/TIMP2及MMP9/TIMP1比值增加(P<0.05)。结论:减少NIH/3T3细胞中IGFBPr P1的表达,可明显抑制细胞的活化,减少TGFβ1的表达,逆转细胞内MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡,减少ECM的合成和分泌而改善肝纤维化。实验四UTMD靶向介导CMB-sh RNA下调IGFBPr P1对小鼠肝纤维化中MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡的影响目的:探讨下调肝纤维化组织中IGFBPr P1的表达是否通过逆转MMPs/TIMPs平衡来减少ECM的产生,从而逆转肝纤维化。方法:(1)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为三组:TAA组:腹腔注射TAA 100mg/Kg,每周3次;TAA+sh RNA-NC组:TAA作用1w后尾静脉注射CMB-sh RNA-NC,行超声靶向微泡破碎(UTMD);TAA+sh RNA-IGFBPr P1组:TAA作用1w后尾静脉注射CMB-sh RNA-IGFBPr P1,行UTMD。标本采集及检测同实验一。(2)C57BL/6野生型小鼠90只随机分为三组:BDL组:实施BDL术;BDL+sh RNA-NC组:BDL术后1w尾静脉注射CMB-sh RNA-NC,行UTMD;BDL+sh RNA-IGFBPr P1组:BDL术后1w尾静脉注射CMB-sh RNA-IGFBPr P1,行UTMD。标本采集及检测同实验一。结果:(1)免疫组化及western blot方法检测肝脏IGFBPr P1等蛋白的表达:随着病变进展,在TAA或BDL致肝纤维化模型,转染sh RNA-IGFBPr P1质粒,小鼠肝组织中IGFBPr P1、TGFβ1、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达均下降(P<0.05)。(2)免疫组化及western blot方法检测肝脏MMPs、TIMPs的表达:在TAA或BDL致肝纤维化模型,分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达,转染sh RNA-IGFBPr P1质粒,各时间点小鼠肝组织中MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1比值增高(P<0.05)。结论:UTMD介导的CMB-sh RNA-IGFBPr P1可显著改善小鼠肝纤维化发展进程,该作用与靶向减少肝组织中IGFBPr P1表达,从而抑制HSC的活化、下调TGFβ1的表达、逆转MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1平衡有关。第四部分小鼠肝纤维化形成中IGFBPr P1对MMPs/TIMPs平衡调节与Hh信号通路的关系实验五Hh信号通路在小鼠肝纤维化发生发展中的表达变化目的:探讨Hh信号通路在IGFBPr P1致小鼠肝纤维化发生发展中的作用。方法:动物分组及处理同实验一、实验二。免疫组化及western blot方法检测肝脏Shh、Gli1蛋白表达,Pearson相关分析肝组织中IGFBPr P1与Shh、Gli1蛋白表达的相关性。结果:(1)免疫组化及western blot方法检测肝脏Shh、Gli1蛋白表达:TAA或BDL作用于小鼠后,随着肝纤维化程度加重,肝脏Shh、Gli1蛋白表达明显增多(P<0.05);Ad IGFBPr P1转染小鼠后,随着肝纤维化发展,肝脏Shh、Gli1表达逐渐增多(P<0.05)。(2)肝组织中IGFBPr P1与Shh、Gli1的相关性分析:在TAA作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与Shh、Gli1的相关系数分别为r=0.910,0.926,P<0.01,呈正相关关系;在BDL作用的小鼠肝组织中,IGFBPr P1与Shh、Gli1的相关系数分别为r=0.918,0.950,P<0.01,呈正相关关系。结论:IGFBPr P1可通过激活Hh信号通路而致肝纤维化。实验六下调IGFBPr P1表达对小鼠肝纤维化发生发展中Hh信号通路的影响目的:探索下调肝纤维化组织或NIH/3T3细胞中IGFBPr P1的表达,Hh通路的变化及意义。方法:细胞分组及处理同实验三,动物分组及处理同实验四。实时荧光定量PCR方法检测细胞中Shh、Gli1 m RNA表达,免疫组化及western blot方法检测细胞或肝组织中Shh、Gli1蛋白表达。结果:(1)实时荧光定量PCR方法及western blot方法检测细胞中Shh、Gli1 m RNA及蛋白表达:细胞转染sh RNA-IGFBPr P1 24h、48h、72h、96h后,Shh、Gli1 m RNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。(2)免疫组化及western blot方法检测细胞或肝组织中Shh、Gli1蛋白表达:UTMD介导sh RNA-IGFBPr P1质粒在TAA或BDL致肝纤维化小鼠体内转染后,随着肝纤维化进展,肝组织Shh、Gli1蛋白表达均相对减少(P<0.05)。结论:减少NIH/3T3细胞或肝组织IGFBPr P1的表达可延缓肝纤维化进程,该作用与抑制Hh信号通路及HSC的活化、TGFβ1表达下调、逆转MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1平衡有关。实验七Hh信号通路特异性抑制剂cyclopamine对IGFBPr P1介导MMP2/TIMP2、MMP9/TIMP1平衡调节的影响目的:明确Hh通路阻断剂cyclopamine是否可以通过抑制Hh信号通路,逆转MMPs/TIMPs平衡,从而减缓IGFBPr P1致肝纤维化进程。方法:(1)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为三组:TAA组:腹腔注射TAA 100mg/Kg,每周3次;TAA+Vehicle组:TAA作用1w后腹腔注射溶剂0.15ml/10g/d,持续2w;TAA+cyclopamine组:TAA作用1w后腹腔注射cyclopamine 15mg/Kg/d,持续2w。标本采集及检测同实验一及实验五。(2)C57BL/6野生型小鼠90只随机分为三组:BDL组:行BDL术;BDL+Vehicle组:BDL术1w后腹腔注射溶剂0.15ml/10g/d,持续2w;BDL+cyclopamine组:BDL术1w后腹腔注射cyclopamine 15mg/Kg/d,持续2w。标本采集及检测同实验一及实验五。(3)C57BL/6野生型小鼠72只随机分为三组:Ad IGFBPr P1组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1;Ad IGFBPr P1+Vehicle组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1 1w后腹腔注射溶剂0.15ml/10g/d,持续2w;Ad IGFBPr P1+cyclopamine组:尾静脉注射Ad IGFBPr P1 1w后腹腔注射cyclopamine 15mg/Kg/d,持续2w。标本采集及检测同实验一及实验五。结果:(1)免疫组化及western blot方法检测肝组织中Shh、Gli1蛋白表达:在TAA/BDL/Ad IGFBPr P1致肝纤维化小鼠,腹腔注射cyclopamine,肝组织中的Shh、Gli1蛋白表达相对减少(P<0.05)。(2)免疫组化及western blot方法检测肝组织中IGFBPr P1、α-SMA等蛋白表达:在TAA/BDL/Ad IGFBPr P1致肝纤维化小鼠,腹腔注射cyclopamine,肝组织中的TGFβ1、α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达相对减少(P<0.05),IGFBPr P1在早期表达无变化,后期表达相对减少(P<0.05)。(3)免疫组化及western blot方法检测肝组织中MMPs、TIMPs蛋白表达:在TAA/BDL/Ad IGFBPr P1致肝纤维化小鼠,腹腔注射cyclopamine,分析各时间点的MMPs、TIMPs蛋白表达后,MMP2/TIMP2及MMP9/TIMP1比值均增高(P<0.05)。结论:Hh通路阻断剂cyclopamine可延缓IGFBPr P1致肝纤维化进程,该作用与抑制Hh信号通路及HSC的活化、TGFβ1表达下调、逆转MMP2/TIMP2与MMP9/TIMP1平衡有关。