目的糖尿病是常见的内分泌代谢疾病,其引发的多种并发症严重危害人们的身心健康,只有建立内源性胰岛素分泌系统才能根治糖尿病。目前主要有胰腺移植和胰岛移植两种方法能达到此治疗目的。胰岛移植属于细胞移植范畴,虽然目前胰岛移植对外源性胰岛素依赖性的解除不如胰腺移植高,但与胰腺移植相比具有安全、简便、利于体外移植物修饰、不良反应较低和可重复性等优点,已成为很有发展前景的治疗方法。虽然如此,胰岛移植仍存在需要解决的问题。第一,获得高质量的胰岛是移植成功的前提条件。目前胰岛的提取方法很多,有常规分离法、胶原酶消化法和自动分离系统等。但就实验角度来讲,胶原酶消化分离、Ficoll梯度离心纯化胰岛仍然是比较理想的方法。第二,减轻排斥反应是移植胰岛长期存活的关键。因为胰岛移植与胰腺移植不同的是,移植后直接暴露在受体的免疫系统攻击下,因而很容易因排斥而失功。目前临床常用的是非特异性的免疫抑制方案来减轻对移植物的排斥反应,这些方案虽能相应延长移植物的寿命,但同时也给机体增加了感染和肿瘤生长的机会。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是存在于骨髓中的一类非造血干细胞,在适宜的条件下能被诱导分化为多种组织细胞,而且其具有独特的免疫学特性。一方面它没有或有很低的免疫原性,不会刺激机体产生免疫反应,这样就可以逃避细胞毒性T细胞和NK细胞的杀伤;另一方面,它又有一定的免疫调节作用,可以降低机体的免疫反应,抑制T细胞的增殖。同时MSCs还是优良的转基因载体。这意味着MSCs在移植领域有重大的意义。另外,若能有效的抑制凋亡、促进细胞的存活,也将对移植物长期发挥功能有利。AKT,亦称蛋白激酶B（ptotein kinase B,PKB）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员,AKT分子量为57KD,在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。根据其产生的组织特异性不同,将AKT分为三种亚型,即AKT1、AKT2、AKT3,它们之间的同源性可达82%。其中AKT1广泛产生于各种组织中,能受多种激活剂调节活化;AKT2也广泛产生,并在卵巢癌和胰腺癌细胞中过量产生;AKT3主要在大脑和睾丸中产生。虽然AKT的作用机制目前尚有很多的未知领域,但AKT作为生存信号的一个重要的组件,随着研究的深入,必将对今后的基础研究和临床应用产生积极的影响。基于AKT与MSCs的上述特点,本实验采用转染AKT1的MSCs与胰岛联合移植来治疗大鼠糖尿病,探讨胰岛长期存活的新方法。材料与方法1.实验动物;供提取MSCs的为一月龄Wistar大鼠,雄性;供体为Wist-ar大鼠,雌雄不限,体重250-300g;受体为SD大鼠,雄性,体重200±5g。于移植前14d,用腹腔内注射2%的链脲霉素（STZ,溶于pH值为4.5的柠檬酸缓冲液中,剂量为60mg/kg）化学烧灼法制作SD大鼠1型糖尿病模型。剪尾测血糖,如果连续3d在非禁食状态下血糖>16.7mmol/L,确定为糖尿病大鼠。将糖尿病大鼠随机分为4组,糖尿病对照组6只,单纯胰岛移植组6只,干细胞和胰岛联合移植组12只,转染AKT1的骨髓间充质干细胞与胰岛联合移植组18只。2.胰岛提取;向供鼠胰管内原位逆行灌注胶原酶溶液（用冷的Hank’s液配制,剂量为1.5mg/ml）10-12ml,使胰腺充分膨胀。切取后在37±1℃水浴中振荡消化,消化时间12-15min。水浴期间间断加入1mol/L NaOH,使消化液的pH值保持在7.8±1。终止消化后,两次离心洗涤,过20目筛。Ficoll梯度离心法纯化胰岛,浓度分别为25%、23%、20.5%和11%,将内含胰岛悬浮物的11%及20.5%Ficoll液段抽出,RPMI-1640洗涤两次备用。获取的胰岛用双硫腙染色来判断所提胰岛的纯度,胰岛细胞数=3次样品中DTZ阳性细胞团数÷3×20×样本总量（ml）。吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光染色法显示细胞活率,体外葡萄糖刺激下胰岛素释放试验检测胰岛活性。3.MSCs培养;采用全血贴壁法培养。取一月龄Wistar大鼠的双侧股骨、胫骨和肱骨,无菌条件下冲出骨髓腔内细胞,吹打成单细胞悬液。接种于25cm²培养瓶,放入37℃、5%CO₂饱和湿度温箱中培养。记录MSCs的生长状况,绘制1、3、5代MSCs的生长曲线。选取P3代MSCs,用流式细胞仪三标抗体（CD34、CD44、CD90）检测MSCs的表面标志。4.AKT1构建和转染;取大鼠肝脏组织300mg,提取总RNA,检测RNA质量后逆转录合成cDNA第一链,然后进行AKT1基因的PCR扩增。构建真核表达载体,大量提取真核表达载体脂粒pcDNA3-AKT1,并对其进行酶切鉴定。取处于对数生长期的MSCs,对其进行AKT1转染。用RT-PCR和Western blot对转染AKT1的MSCs进行检测。5.肾被膜下移植;首先将所要移植的内容吸到微量加样器中,离心,使胰岛或/和MSCs（转染或非转染）汇集到加样器前端。乙醚麻醉受者糖尿病大鼠。腹卧位,术区消毒,经右侧肋缘下斜切口入腹,显露右肾,并将其拖出体外,用微量加样器将胰岛注射到肾被膜下,注射完毕后将肾还纳回腹腔,关腹,消毒术区。5.1单纯移植胰岛组;注射约300IEQ的胰岛。5.2 MSCs和胰岛联合移植组;转染AKT1组和未转染AKT1组所移植的MSCs均为1×10⁶个左右,分别与300IEQ胰岛进行联合移植。5.3对照组糖尿病大鼠;注射相应体积的1640溶液（约为15-20μl）。6.血糖监测;取尾血,用便携式血糖仪检测血糖。各组术后10d内每日测量一次,以后每周2次。7.胰岛素检测;MSCs和胰岛联合移植组于术后4d和11d测量,以后每周一次。经眶内静脉丛采血,每次取血约1ml,静置,待血清析出后离心,取血清送检。8.OGTT;试验前禁食12h-14h,用50%的葡萄糖以2g/kg的剂量灌胃,测定0、15、30、60、90及120min血糖。分别在血糖正常后3d、术后10d、术后30d测量。9.形态学检测;术后第10d各组处死6只;术后30d转染和非转染组各处死6只;术后90d转染组处死6只。取肾脏组织作HE和Insulin-6免疫组织化学染色,观察形态学变化及胰岛存活情况。10.统计学分析;将所得数据用均值±标准差表示。t检验进行处理,P<0.05认为有统计学意义。结果1.胰岛提取;平均每只大鼠可获得约600IEQ胰岛,经DTZ染色后,纯度>90%。胰岛活率>98%。体外葡萄糖刺激下胰岛素释放试验表明,在低糖溶液中胰岛素平均含量为80.7±6.3μIU/ml,高糖溶液中胰岛素平均含量为257.4±12μIU/ml,释放指数（SI）为3.64±1.92。2.大鼠MSCs 1、3、5代细胞生长曲线基本相同,形态趋于一直,经流式细胞仪检测MSCs的表面标志,荧光三标的结果均一性达到95%左右。CD44、CD90阳性,共同阳性率约为97%,CD34阴性,而此时CD90阳性率约为96%。3.经BamHI和EcoRI双酶切电泳和质粒测序证实本研究构建的AKT1表达载体构建成功,经Lipofectamine 2000转染MSCs,RT-PCR及Western检测结果显示,在MSCs中已表达AKT1基因的mRNA和蛋白。4.血糖监测、胰岛素水平和OGTT;各组糖尿病大鼠移植当天血糖既开始下降,3d后血糖下降至正常。（1）单纯胰岛移植组;胰岛存活时间在6d左右。血糖正常3d天后进行口服糖耐量试验,曲线介于正常大鼠与糖尿病大鼠之间,其它两组曲线也与此相似。由于取血量的限制,没对此组做胰岛素检测。（2）干细胞与胰岛联合移植组;血糖维持平稳持续时间大约在25d,胰岛素分泌量与血糖分泌相协调。第二次OGTT与正常大鼠没有统计学差异,而第三次已经有下降趋势。（3）转染AKT1的MSCs与胰岛联合移植组;血糖水平、胰岛素水平及后两次OGTT水平均较正常无明显区别。5.形态学检测;首次取材;单纯移植组排斥反应较明显,胰岛细胞胰岛素分泌少;其余两组胰岛素分泌较多。第二次取材;干细胞组已有排斥反应,胰岛素分泌减少;转染组较以前无明显变化。第三次取材;转染组仍没有明显的变化。结论1.胶原酶原位灌注、Ficoll梯度离心的胰岛提取方法可获取高质量的胰岛。2.肾被膜下是胰岛移植的可行部位。3.MSCs可减轻机体对移植物的排斥反应。4.AKT1对胰岛的生存有保护作用。