慢性应激（Chronic Stress,CS）指刺激持续时间较长,且引起机体反应持续时间也较长的应激。在妊娠期,限位栏饲养会造成母猪CS,导致妊娠母猪免疫能力下降、疾病发病率增加,产仔量减少,产弱仔,仔猪发育不良等,影响养猪业经济利益。由于CS导致免疫能力下降发病机理未明,所以,探究限位饲养导致妊娠母猪CS进而引发免疫能力下降的致病机理,以及探索有效的治疗药物至关重要。研究表明CS可引起脾脏内质网发生未折叠蛋白反应,线粒体、内质网是细胞内两个能够决定细胞命运的细胞器,在病理情况下,细胞发生氧化应激,二者相互靠近,形成线粒体-内质网结构偶联（MAMs）,并在此区域迅速搭建IP3R/GRP75/VDAC1钙离子快速通道,将两个细胞器在结构和功能上紧密连接,以应对外界刺激,但此机制是否参与CS致脾脏损伤病理过程尚未明确。褪黑素（Melatonin,MT）可直接作用于线粒体外膜,减少ROS生成,在抗氧化、免疫及HPA轴调节方面发挥重要作用,故推测MT可通过减少线粒体ROS生成、减弱内质网未折叠蛋白反应、减少MAMs生成以及调节线粒体动力学失衡对CS致脾脏损伤起到保护作用。然后通过猪场CS防治试验,探究MT在缓解限位栏饲养导致妊娠母猪CS中的作用效果。前期猪场试验,对限位饲养妊娠母猪及圈养妊娠母猪进行行为学观察及信息录入,然后进行耳缘静脉采血,检测其血常规指标、HPA轴相关指标、氧化应激相关指标以及免疫相关指标,将结果进行比对分析。为探究CS对免疫系统的影响及解决方式,在实验室阶段,课题组将4组SD孕鼠,C组、CS组、CS+M组（10 mg/kg MT）、CS+A组,采取将大鼠束缚18 d,每天6 h,建立大鼠CS模型,每天在束缚前1 h腹腔注射给药。在第19 d,每组选取6只孕鼠,进行旷场试验,然后进行心脏采血和取样。检测血常规、脾脏结构、HPA轴相关指标、氧化应激相关指标、免疫相关指标、线粒体动力学、内质网应激、线粒体-内质网结构偶联（MAMs）相关因子的m RNA及蛋白的表达情况。为了验证MT对CS导致免疫能力下降的治疗效果,进行猪场CS防治试验。课题组根据前期猪场试验的统计结果,以限位饲养五产妊娠母猪为研究对象,在限位的第21 d（妊娠第50 d）,按照3 mg/d的剂量,将MT添加在早上的饲料里,进行饲喂,连续饲喂21 d,在妊娠的第71 d早上饲喂前,耳缘静脉采血,检测其血常规指标、HPA轴相关指标、氧化应激相关指标以及免疫相关指标,比较MT对限位饲养妊娠母猪造成的CS及免疫功能的影响。试验结果表明:（1）限位饲养妊娠母猪采食量减少,食槽剩余饲料,精神萎靡,反应迟钝,对周边事物失去兴趣,常表现出啃栏、啃槽和无食咀嚼的规癖行为。HPA轴相关指标中,CRF、ACTH和CORT水平显著上升,DA、5-HT水平显著下降,HPA轴激活,表明限位饲养导致妊娠母猪CS。（2）限位饲养导致妊娠母猪CS后,血清中GSH、GSH-Px含量,CAT、SOD、GSH-Px活性显著降低,MDA含量显著升高,表明限位饲养可导致妊娠母猪机体内部发生氧化应激反应。血浆中白细胞数、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比降低,中性粒细胞百分比升高,血清CD3、CD4含量显著降低,CD8显著升高,CD4/CD8比值显著降低,表明限位饲养可致妊娠母猪免疫能力下降。（3）CS大鼠在旷场试验中,静止时间显著延长,运动总路程、跨格次数和站立次数显著减少,血清中CORT、CRF和ACTH水平显著升高,DA、5-HT水平显著下降,表明大鼠探索欲降低,HPA轴激活,CS模型造模成功。（4）CS大鼠脾脏GSH、GSH-Px含量显著降低,CAT、SOD活性显著降低,MDA、ROS含量显著升高。给予MT后,GSH含量显著升高,CAT、SOD、GSH-Px活性显著升高,MDA和ROS含量显著降低,表明CS可导致大鼠脾脏发生氧化应激,MT起到保护作用。CS大鼠血液中白细胞、淋巴细胞显著减少,淋巴细胞百分比显著降低,中性粒细胞百分比显著升高,血清CD3含量显著降低,CD4含量显著降低,CD8显著升高,CD4/CD8比值显著降低,给予MT后,逆转了指标异常,表明CS可导致大鼠免疫能力下降,MT起到缓解作用。（5）CS大鼠脾脏显著肿大,脾脏系数显著升高;病理组织学观察显示脾脏结构受损,白髓结构疏松紊乱,中央动脉肿胀,边缘区部分消失,白髓、红髓分界不清;电镜结果显示,脾脏细胞超微结构受损,细胞核固缩浓染,内质网和线粒体肿胀且数量增多,线粒体-内质网结构偶联增多。给予MT后,形态结构恢复正常。表明MT对CS大鼠脾脏结构起到保护作用。（6）CS大鼠脾脏细胞中Drp1、Fis1的m RNA表达量显著升高,Opa1、Mfn1、Mfn2的m RNA表达量显著降低,p-Drp1 S616/Drp1比值显著升高,Fis1的蛋白表达量显著升高,Opa1、Mfn1和Mfn2的蛋白表达量显著降低,给予MT后,逆转了指标异常,表明CS可致大鼠脾脏细胞线粒体动力学失衡,MT对其起到缓解作用。IRE1、ATF6、PERK的m RNA表达量显著升高,GRP78的m RNA表达量无显著变化;p-IRE1a、ATF6a、p-EIF2a的蛋白表达量显著升高,GRP78的蛋白表达量无显著变化。给予MT后,逆转了指标异常,恢复至对照组水平,表明CS可致大鼠脾脏细胞发生未折叠蛋白反应,MT对其起到缓解作用。IP3R、GRP75、VDAC1的m RNA和蛋白表达量显著升高,给予MT后,逆转了指标异常,表明CS可致大鼠脾脏细胞发生线粒体-内质网偶联,MT对其起到缓解作用。（7）限位饲养五产妊娠母猪血清CRF、ACTH和CORT水平显著上升,DA、5-HT水平显著下降,MT逆转了HPA轴相关指标异常,表明MT对限位饲养导致的妊娠母猪CS起到保护作用。（8）限位饲养五产妊娠母猪血清GSH含量、CAT、GSH-Px活力显著降低,SOD含量降低,但无显著差异,MDA含量显著升高。给予MT后,GSH含量显著升高,GSH-Px活性显著升高,其他指标也有一定程度恢复,但无显著性差异。表明MT对限位饲养致五产妊娠母猪机体发生氧化应激具有一定的缓解作用。限位饲养五产妊娠母猪白细胞数显著降低,淋巴细胞数和淋巴细胞百分比显著降低,中性粒细胞百分比显著升高,给予MT后,白细胞数显著升高,中性粒细胞百分比显著下降,淋巴细胞数和淋巴细胞百分比升高,但无差异显著性变化。血清CD3、CD4含量显著降低,CD8含量显著升高,CD4/CD8比值显著降低,给予MT后,各指标均得到一定程度恢复,表明MT可缓解限位饲养导致的妊娠母猪免疫能力下降。结果表明,限位饲养可致妊娠母猪CS,并引起血清CD3、CD4、CD8含量变化,CD4/CD8比值降低,影响机体免疫能力,其中五产妊娠母猪发病率最高,初产妊娠母猪发病率次之。在大鼠CS模型上,MT可抑制大鼠行为学异常、HPA轴紊乱、脾脏组织病理学变化、氧化应激及免疫相关指标异常,且MT可以通过纠正CS大鼠脾脏细胞线粒体动力学失衡、减轻内质网未折叠蛋白反应以及减弱线粒体-内质网结构偶联的方式,来维持大鼠脾脏细胞稳态,从而对CS大鼠脾脏起到保护作用。在猪场MT防治试验中,MT能够抑制限位饲养导致的妊娠母猪CS,且对妊娠母猪免疫相关指标异常起到一定的缓解作用,表明MT是一种具有潜力的缓解限位饲养致妊娠母猪CS以及提高妊娠母猪免疫能力的药物。