大豆（Glycinemax）原产于中国,营养价值丰富,既可以制作豆腐、豆浆、豆芽等豆制品,又可以榨油,广泛渗透于人们日常饮食的方方面面。然而,由于世界大豆种植面积的1/3为酸性土壤,而酸性土壤因其pH低,溶解态铝离子含量高,从而对大豆产生毒害。铝毒首先抑制大豆根部生长,破坏根细胞内部结构,进而导致根系水分养分吸收受阻,从而影响大豆生长发育,降低大豆的产量与品质。在植物的长期进化中已经形成了分泌有机酸、合成铝转运蛋白、提高氧化酶活性等应对铝毒害的机制。WRKY转录因子家族利用其N端保守的“WRKYGQK”基序及C端的类锌指结构,识别并结合到胁迫响应基因启动子上的W-box,进而激活或抑制这些基因的转录与表达,从而在植物生物及非生物胁迫中发挥调节作用。WRKY蛋白家族基因在植物耐盐、耐旱、耐热及耐低磷胁迫方面的功能均有报道,但耐铝功能报道较少。本研究选择了实验室前期大豆耐铝毒转录组发现的一个Gm WRKY6基因作为耐铝毒候选基因,通过对该基因的生物信息学分析、组织表达及铝诱导表达分析、基因克隆与序列比对、亚细胞定位、转基因大豆发根的耐铝性鉴定、转基因拟南芥及相应突变体的耐铝表型鉴定及酵母双杂筛选互作蛋白等方法,对Gm WRKY6基因的耐铝功能进行了初步探究。获得的主要研究结果如下:1、GmWRKY6基因的生物信息学分析。Gm WRKY6基因的全长是1437bp,编码478个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有一个W RKY结构域（DN A结合结构域）,54个磷酸化位点,是一个不稳定的亲水性蛋白。GmWRKY6蛋白含有一个“WRKYGQK”保守基序及一个C2H2型类锌指结构,因而属于WRKY家族中的第二类蛋白。GmWRKY6基因的启动子区包含多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件。进化树分析表明,与大豆中的GmWRKY6亲缘关系相近的蛋白有蒺藜苜蓿中的Medtr3g053330 和红车轴草中的 Tp57577TGAC。2、GmWRKY6基因的表达分析。Gm WRKY6基因在大豆的茎、叶中表达水平较低,但在根中表达水平很高。用pH=4.3,25 uM的AlCl3处理6 h、12 h、24 h时,耐铝大豆品种M90-24和感铝大豆品种Pella中Gm WRKY6基因均受铝毒诱导而上调表达,且在耐铝大豆品种M90-24中Gm WRKY6基因的上调倍数极显著高于感铝大豆品种Pella。亚细胞定位结果表明,GmWRKY6蛋白定位于细胞核中,是一个核蛋白。3、Gm WRKY6基因克隆与序列比对分析。分别从耐铝大豆品种M90-24和感铝大豆品种Pella中克隆GmWRKY6基因的编码区序列（coding sequence,CDS）和启动子序列。序列比对结果显示,两个大豆品种中Gm WRKY6基因的CDS序列存在4个非同义突变导致两个品种中的GmWRKY6蛋白存在4个氨基酸差异。GmWRKY6基因的启动子序列存在多处单核苷酸差异与插入/缺失（InDel）差异。Gm WRKY6的以上序列变异是否导致功能差异有待进一步研究。4、过表达Gm WRKY6基因对大豆发根耐铝性的影响。从耐铝大豆品种M90-24中克隆Gm WRKY6基因,构建pBinGFP4-35S:GmWRKY6载体,利用农杆菌介导的大豆发根转化技术分别获得过表达Gm WRKY6基因和转空载体的大豆发根嵌合体植株。铝毒处理后,过表达Gm WRKY6基因和转空载体的大豆嵌合体植株地上部生长情况差别不大,而过表达Gm WRKY6基因的嵌合体植株的总根长、主根长、根部鲜重及干重均显著高于转空载体植株。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的过表达有利于缓解铝毒害对大豆发根生长的抑制作用,从而提高大豆发根嵌合体植株的耐铝性。5、GmWRKY6过表达拟南芥和wrky6突变体的耐铝表型鉴定。AlCl3处理下,过表达GmWRKY6基因的拟南芥根长极显著高于野生型拟南芥,而wrky6突变体拟南芥的根长极显著低于野生型拟南芥,表明过表达Gm WRKY6基因可以减少铝毒对拟南芥的抑制程度,从而增强拟南芥的耐铝性,而WRKY6基因功能缺失的突变体拟南芥对铝胁迫更敏感。综上所述,WRKY6基因在植物耐铝中可能发挥着重要作用。6、GmWRKY6互作蛋白的筛选。通过构建pBKT7-GmWRKY6载体,验证GmWRKY6没有自激活活性,进一步将其与酵母文库质粒共转化,共筛选得到3个可能与GmWRKY6互作的蛋白,分别是叶绿体Gu/Zn超氧化物歧化酶、叶绿体ATP合酶、SRG1蛋白。已有研究报道这些蛋白可能参与植物对逆境胁迫的响应。它们具体是否能与GmWRKY6相互作用,以及是否参与大豆耐铝性仍需进一步验证。