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哺乳动物的毛色差异主要由黑色素细胞的数量、黑色素的含量和黑素体在周围角质化细胞群的分布情况决定。关于哺乳动物毛色的大量研究表明,许多基因可以影响黑色素细胞的生长和迁移。因此,黑色素细胞可以为研究调控毛色的基因奠定基础。EDN1是内皮素家族的成员之一,对黑色素细胞有促进有丝分裂和黑色素生成的作用。EDN1与黑色素细胞上G蛋白偶联受体结合,激活一系列的信号通路。为了探究绵羊皮肤黑色素细胞的体外培养和鉴定方法,建立绵羊皮肤黑色素细胞培养体系,进而为研究调控毛色的基因提供理想的生物学材料。本研究采用Dispase Ⅱ酶和trypsin/EDTA消化法，进行细胞原代和传代培养,获得纯化的绵羊皮肤黑色素细胞,并鉴定其生物学特性;利用添加不同浓度EDNl(10-10 mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L和10-7 mol/L)的培养基培养细胞,以检测EDN1对黑色素细胞的增殖、黑色素的生成以及相关基因表达的影响,进而分析EDN1对绵羊皮肤黑色素细胞内黑色素生成的影响。主要的研究内容和结果如下：1.黑色素细胞的原代和传代培养,观察其各个阶段的形态。结果显示,12h后黑色素细胞开始贴壁,有两极树突状突起(图2-1A),24h后树突状突起明显;(图2-1B)。约7d后，细胞融合度约80%,有典型的树突状结构。2.利用MTT法测定其增殖,以绘制黑色素细胞生长曲线。测定结果显示,1～2d时细胞缓慢生长,3d后进入对数生长期,第7天时减缓,进入停滞期(图2-2)。3.黑色素细胞的生物学鉴定,包括L-Dopa染色、免疫细胞化学染色和 RT-PCR。经鉴定,黑色素细胞生物学功能正常。4.不同浓度EDN1的培养基中作用72h后,对照组(0mol/L)的黑色素细胞呈双树突或三树突状突起,但是突起不明显(图3-1A)；而实验组的黑色素细胞形态呈明显的树突状突起(图3-1B、C、D、E)。5.MTT法分析黑色素细胞的增殖率,实验组与对照组(0,mol/L)相比,有明显的增殖(P<0.05),且在EDN1浓度为10-1O mol/L时增殖效果最明显(P<0.01),在10-7mol/L、 10-mol/L、10-9 mol/L时增殖率较低(表2)。6.实验组与对照组(0 mol/L)目比,黑色素含量明显升高(P<0.05),且在EDNl浓度为10-10 mol/L时效果最明显(P<0.01),在10-7 mol/L、10-8 mol/L、10-9 mol/L时黑色素含量较低(表3)。7. qRT-PCR检测EDN1对目的基因(MITF、MC1R、TYR和EDNRB) mRNA表达水平的影响。经SPSS17.0统计学软件分析得：10-9 mol/L时，MITF mRNA表达水平是对照组的1.95倍;10-7 mol/L时，MC1R、TYR和EDNRB基因mRNA表达水平分别是对照组的5.50、1.34和3.84倍(P<0.05)。本研究成功建立了绵羊皮肤黑色素细胞的培养体系。适当浓度的EDN1可促进体外培养的绵羊皮肤黑色素细胞的增殖、树突增多以及黑色素的合成,同时还可以影响相关基因(MITF、MC1R、TYR和EDNRB) mRNA的表达量。在黑色素细胞内,内皮素与其受体结合,调节相关的信号转导通路,进而调控绵羊的毛色。