白癜风（Vitiligo）是一种由于黑素细胞特异性损害而致色素脱失的获得性皮肤病，症状为皮肤出现局限性或泛发性色素脱失斑，此病由皮肤和毛囊的黑色素脱失所引起，是一种容易诊断而难于治疗的皮肤病。近期研究发现，黑素细胞生长存活缺陷，已成为白癜风皮损中黑素细胞丢失的一个主要原因，因此，抑制黑素细胞凋亡是白癜风治疗的一个重要潜在靶点。研究发现，在黑素细胞中，Bcl-2是最主要的细胞凋亡抑制基因，Bax（Bcl-2associated X protein，Bcl-2相关蛋白X）则是最主要的细胞凋亡促进基因，因此，将Bcl-2质粒与Bax的小干扰RNA片段以一定的比例导入到黑素细胞内，可有效地控制黑素细胞凋亡。本课题的研究目标是利用RNA干扰/DNA表达的双向基因调控技术，依靠α-黑素细胞刺激（α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）与黑素细胞表面的黑皮素-1受体（melanocortin1receptor，MC-1R）的特异性结合作用，以低分子量聚乙烯亚胺（low molecular weight polyethyleneimine，LMW PEI）为基因载体，构建一个靶向于黑素细胞的聚阳离子基因纳米复合物给药系统。主要研究内容分为两部分：一方面，利用具有亲水亲脂两性基团的普朗尼克（Pluronic）连接低分子量聚乙烯亚胺，形成高分子聚合物，探讨其分子量大小、结构特征、水解能力、细胞毒性及转染效率等性质，以期得到一个更加安全、有效的阳离子聚合物基因载体；同时，在该载体上连接黑皮素-1受体的配体，作为靶向头基，实现黑素细胞的靶向；另一方面，利用RNA干扰/DNA表达的双向基因调控技术，将小干扰RNA片段/质粒包裹于上述载体，在抑制bax过表达的同时促进bcl-2表达，从而达到抑制黑素细胞调亡的目的，为白癜风等因黑素细胞特异性损害而致的疾病提供一条新的有效的治疗途径。本文主要从以下几部分进行研究：第一部分，低分子量聚乙烯亚胺阳离子聚合物的合成及聚阳离子/DNA纳米复合物的理化性质、体外转染和毒性评价。使用三光气＋N-羟基琥珀亚酰胺法将不同种类Pluronic双端羟基活化并与低分子量PEI反应，利用凝胶渗透层析色谱法（GPC）对所得的产物进行分子量测定，利用核磁共振（NMR）对其结构进行测定，测定聚合物在外界环境下的水解能力，制备不同质量比的聚阳离子/DNA纳米复合物，利用马尔文微粒测定仪等测定影响复合物粒径、Zeta电位和稳定性的因素；使用琼脂糖凝胶电泳考察不同质量比条件下阳离子聚合物对DNA的浓缩能力，考察聚阳离子/DNA复合物抗酶解能力，选择Hela细胞株进行体外转染实验；采用CCK-8法测定细胞毒性。第二部分，Bcl-2/Bax的双向基因策略调节细胞凋亡的体外评价。构建Bcl-2表达质粒，验证其体外表达效率；参考文献进行小干扰RNA片段合成并验证，获得有效的Bax干扰小RNA；采用优化比例的混合核酸，经聚阳离子纳米复合物包裹后体外转染黑素细胞，进行基因表达与凋亡评价。第三部分，使用α-黑素细胞刺激素修饰第一部分所得聚合物，得到含有靶向头基的载体材料；将包裹了DNA和RNA的聚阳离子纳米复合物与黑素细胞在体外培育，对其粒径及Zeta电位进行测定，并考察其稳定性，体内外靶向性，以及促进黑素细胞增殖的效果。第四部分，双向基因调控的聚阳离子纳米复合物抗凋亡作用研究及安全性评价。构建白癜风的小鼠动物模型；通过皮肤亮度效果评价和黑素细胞数量变化评价其治疗效果；通过动物血常规及肝、肾功能检测，病理组织的免疫组化检测，给药系统溶血性考察等评价该复合物的安全性。综上所述，为了抑制黑素细胞的凋亡，本课题通过基因治疗的方法，利用RNA干扰/DNA表达的双向基因调控技术，以黑皮素-1受体介导的靶向于黑素细胞的低分子量聚乙烯亚胺阳离子聚合物为载体，将外源的基因导入生物细胞内，使Bcl-2的表达提高的同时，抑制Bax基因的表达，从而起到防止黑素细胞凋亡的作用，保证其在体内发挥正常的生理作用。这种利用双向基因调控来抑制黑素细胞凋亡的研究在国外未见到相关报道，同时以α-黑素细胞刺激素作为配体，起到黑素细胞靶向作用的研究亦未见报道，因此，本项目的研究，有望为白癜风等皮肤病的临床治疗开辟一条新的途径。