大黄鱼LEAP-2基因的鉴定及功能解析

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抗菌肽 LEAP-2是一类主要在肝中表达的抗菌肽,在宿主先天免疫系统起着至关重要的作用。在本研究中,我们从大黄鱼中克隆出两种 LEAP-2基因,分别命名为 LcLEAP-2 A和LcLEAP-2 C。两者均含有3个外显子和2个内含子。在正常的大黄鱼体内,LcLEAP-2 A在所检测的组织中均有表达,在肝脏和肠中有较高的表达量。而 LcLEAP-2 C在所检测的组织中的mRNA表达量明显低于LcLEAP-2 A。采用实时荧光定量 PCR对溶藻弧菌侵染大黄鱼前后组织中LEAP-2 A和LEAP-2 C mRNA表达变化进行检测。实时荧光定量 PCR结果显示,在溶藻弧菌感染后,LcLEAP-2 A在大黄鱼肝脏、体肾、脾、头肾、鳃中的表达量均显著上调,然而在肠中的表达量却有所下调。此外,LcLEAP-2 C在所有检测的组织中均有明显上调,包括在肠中的表达。通过原核表达系统表达大黄鱼LcLEAP-2A和LcLEAP-2C的ORF,成功构建 PGEX-3X-LcLEAP-2A和PGEX-3X-LcLEAP-2C重组子,转至大肠杆菌经 IPTG诱导后,获得目标蛋白用以后续实验的研究。此外,采用化学合成的方法人工合成 LcLEAP-2A和LcLEAP-2C的成熟肽,用于体外抑菌实验的研究。实验结果证明 LcLEAP-2A和LcLEAP-2C成熟肽在体外对多种细菌和真菌具有不同的抗菌能力。LcLEAP-2C对溶藻弧菌具有明显的抗菌能力,而 LcLEAP-2A对溶藻弧菌没有明显的抗菌能力。本文进一步检测了高剂量和低剂量的LcLEAP-2C对溶藻弧菌感染大黄鱼后,其存活率、组织载菌量及促炎性细胞因子表达的变化。实验结果表明,低剂量的LcLEAP-2C提高了大黄鱼的存活率,降低了组织中的载菌量,同时还降低了促炎因子肿瘤坏死因子 TNF-α和白介素因子 IL-1β在 mRNAs水平上的表达量。以上实验结果表明,LcLEAP-2通过直接抗菌能力和抑制大黄鱼早期炎症反应来提高大黄鱼对溶藻弧菌的防御能力,在先天免疫中起着重要的作用。
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