成人慢性牙龈炎和牙周炎是最常见的牙周疾病。牙龈卟啉菌是目前公认的牙周病原菌，在牙周炎患者中有较高的检出率。本研究首先通过扩增牙菌斑细菌中牙龈卟啉菌的16S rRNA基因片段，并进行克隆及测序，以建立一种适合临床应用的牙龈卟啉菌特异性检测方法，并为该方法应用于其他牙周细菌提供依据。以牙龈卟啉菌检测方法为基础，应用PCR扩增16SrDNA片段的方法来检测慢性牙龈炎和牙周炎患者龈下菌斑中的10种牙周病原菌的分布，并初步分析这些细菌在牙周病发病中可能的作用。论文分为两部分。 论文第一部分 牙龈卟啉菌16S rRNA基因片段的克隆及序列测定 目的 通过对临床采取的牙周袋菌斑中牙龈卟啉菌的16S rRNA基因(16S rDNA)片段的扩增，并进行克隆及序列测定，确立一种临床检验该菌的方法，并为该方法应用于其他牙周细菌提供依据。材料与方法 从牙周炎患者牙周袋内采集龈下菌斑标本，提取菌斑中细菌DNA，同时提取Pg381标准株的DNA作为阳性对照，使用牙龈卟啉菌的16S rRNA基因片段的特异引物，TaqDNA聚合酶等在适宜的条件和温度下进行聚合酶链式反应，反应产物在加入0.5ug／ml溴化已锭(EB)的1.5％琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下进行观察，采用DL2000 DNA marker记录电泳DNA片段大小，并将电泳产物DNA片段回收，回收产物连至T载体，连接产物转至新制备的大肠杆菌感受态细胞内，在含有氨苄青霉素(Amp)的LB-琼脂平板培养基上培养，挑取阳性转化子，先使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，增菌后提取质粒。然后进行双酶切(HindⅢ／Xba Ⅰ)鉴定，酶切结果在琼脂糖凝胶中电泳进行观察，记录电泳DNA片段大小。最后测定插入质粒中的DNA片段序列。结果 部分牙周炎患者龈下菌斑中含有的细菌DNA可军医进修学院硕士学位论文用聚合酶链式反应扩增出一段200 bp左右的DNA片段，与Pg381标准株相同，标本扩增产物回收后，连接到T载体转至大肠杆菌，在含有Amp的LB筛选平板上得到阳性转化子，增菌提取质粒后进行双酶切鉴定证实确有200 bp左右的DNA片段已插入，测出的序列与Genbank中牙馥叶琳菌的165 rRNA基因片段吻合。结论聚合酶链式反应能够扩增出牙跟叶琳菌部分165 rRNA基因片段，可用于临床样本水平上牙龋叶琳菌的检测。论文第二部分牙周病原菌在牙周病人银下菌斑中的分布研究 目的应用聚合酶链式反应分别检测牙周病人酿下菌斑中的10种牙周病原菌，观察其分布特点，并初步分析不同的细菌组合与牙周病的关系。材料与方法将聚合酶链式反应扩增出牙酿叶琳菌部分165 rRNA基因片段的实验方法推广致更多的牙周病病原菌。根据各自特异区的165 rRNA基因(165 rDNA)序列，分别合成10种牙周病病原菌:牙跟叶琳菌(Pg)，福塞类杆菌(Bf)，中间型普里沃菌(Pi)，齿垢密螺旋体(Td)，变黑普里沃菌(Pn)，直型弯曲杆菌(Cr)，溶蚀艾肯菌(Ec)，放线共生放线杆菌(Aa)，黄褐二氧化碳噬纤维菌(C。)，生痰二氧化碳噬纤维菌(CS)的特异引物，然后随机选择62位患者，其中牙周健康者16例，慢性边缘性牙跟炎患者17例，慢性牙周炎患者29例，每例选两个位点，分别取两份跟下菌斑标本，共124份样本。同时记录各病例的一般情况:年龄，性别，吸烟情况和各项临床指标:探查袋深，探诊出血情况等，牙周炎患者同时记录附着水平。提取菌斑中的DNA，分别用10对特异引物，TaqDNA聚合酶等在适宜的条件和温度下进行聚合酶链式反应，反应产物在加入0.sug/m1澳化已锭(EB)的1.50rk琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下进行观察，采用DLZ000 DNA marker记录电泳DNA片段大小，检测是否出现与特异引物相对应的特异扩增带，以鉴定细菌种类。用统计软件分析细菌与病例一般情况与各项临床指标的关系。结果10种牙军医进修学院硕士学位论文周病病原菌在各组中都有检出，其中跟炎组牙跟叶琳菌(Pg)，中间型普里沃菌(pi)和齿垢密螺旋体(Td)的检出率高于健康组;牙周病组牙龋叶琳菌(Pg)，福塞类杆菌(Bf)，中间型普里沃菌(Pi)，齿垢密螺旋体(Td)，变黑普里沃菌(Pn)和黄褐二氧化碳噬纤维菌(Co)的检出率高于健康组;牙周病组的中间型普里沃菌(Pi)，齿垢密螺旋体(Td)和变黑普里沃菌(Pn)高于龋炎组。随年龄增大，齿垢密螺旋体( Td)的检出率增加;女性龋下菌斑中的牙跟叶琳菌(Pg)检出率多于男性;不吸烟者患者中检出较多的牙龋叶琳菌(Pg)。中间型普里沃菌(Pi)、齿垢密螺旋体(Td)和变黑普里沃菌(Pn)与牙周病关系更为密切。结论我国人群的牙周病病原菌的分布有自己的特点。中间型普里沃菌、齿垢密螺旋体和变黑普里沃菌与牙周病关系较为密切。