特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）为间质性肺疾病（interstitial lung disease）最为严重的一种表现形式，是以弥漫性肺泡慢性炎症和间质纤维化为主要病理特征的疾病。近年来间质性肺纤维化的发病率呈上升趋势。目前在世界范围内将近有500万人罹患此症，该类患者平均寿命仅为2.8年，每年约40000患者因之而死亡。此病在我国发病率也有明显增加。目前已知的引起肺纤维化的因素有：辐射和药物，主要见于癌症治疗中放射治疗和化疗药物引起的肺损伤；职业暴露，主要见于作业工人长期吸入粉尘所致的尘肺；遗传因素，主要有囊性肺纤维化；其它因素还有结节病（Sarcoidosis）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺结核、肺真菌感染、肺寄生虫病哮喘、SARS、流感和禽流感病毒人间感染等。肺纤维化具有潜在的庞大发病基础，许多常见的基础性疾病均有可能引起肺部的纤维化，应该引起医学制药领域的更大关注。而因职业和环境暴露引起的尘肺是相关从业人员的一大健康杀手。在我国，所有职业病中，危害最为严重的当数尘肺。对于矽肺、矿工尘肺等相对常见的尘肺，除了采取有效防护措施外，迄今仍缺乏可靠而有效的治疗方法。目前对IPF的治疗主要采用皮质激素和免疫抑制剂，以对抗炎症，仅有部分患者有效，但效果并不令人满意。美国西雅图华盛顿医学中心大学的Ganesh Raghu博士认为，皮质激素加用或不加用一种免疫抑制剂的疗法是用于IPF患者的最普遍的治疗方法。但这类患者用皮质激素的临床有效率仅为20％～30％。Raghu认为，IPF患者使用皮质激素加用或不加用免疫抑制剂的疗法的另一个问题是对最适剂量和治疗疗程所知甚少，且不良反应的发生率高，此外，只有很少的资料支持皮质激素用于这一适应证。在我国，虽然2002年4月中华医学会呼吸病学分会制定了IPF的诊断和治疗指南（草案），但迄今尚没有一种令人满意的治疗方法。吡非尼酮（pirfenidone PF）是一种新型的广谱抗纤维化药物，其结构是5-甲基1-苯基2（1氢）吡啶酮（5 methyl-1-phenyl-2（1H）-pyridone）。它能抑制胶原的合成，阻止甚至逆转纤维化发生和瘢痕形成。本品易于为胃肠道所吸收，在体内各组织中分布广泛，可通过血脑屏障。基于本品对肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的拮抗作用，有可能被用于多发性硬化症（MS）和类风湿性关节炎（RA）的治疗。作为特发性肺纤维化治疗药物，PF已经被认定为罕用病治疗药物（orphan drug）在美国进行各项开发研究，并根据美国一项名为“Early Access Program”项目用于一定数量的特发性肺纤维化患者。同时，本品也亦己被日本厚生省指定为“孤儿药物”。2003年，InterMune公司宣布的一项随机双盲多中心Ⅱ期临床研究结果表明，本品治疗特发性肺纤维化比皮质激素泼尼松更为有效。此项研究共入选53例患者，其中，中至重度特发性肺纤维化患者有46例，继发性肺纤维化患者7例。患者每日口服PF 40 mg·kg^-1或泼尼松0.33mg·kg^-1。接受治疗12个月后，以最低氧饱和度为考察指标，结果显示本品的治疗效果优于泼尼松；6分钟步行测试结果表明治疗组疗效明显优于泼尼松治疗组（p=0.014）。通过对其它临床终点指标的考察，如用力肺活量（FVC）、步行距离等，本品治疗组也均优于泼尼松组，且具有良好的耐受性。PF的抗纤维化作用已经在多种试验动物纤维化模型中得到证实。在体外实验中发现PF能抑制成纤维细胞的增殖和活性，减少TGF-β的表达。在博莱霉素诱导的鼠肺纤维化模型中发现它能抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA的表达，抑制巨噬细胞产生PDGF，减少羟脯氨酸的产生，并能改善肺功能。但文献中对该药的药代动力学研究报道较少，Giri SN等以放射性PF[苯环标记上¹⁴C（U）]进行小鼠静脉注射后药动学研究，发现本品半衰期约为8.6分钟。静脉给药后PF快速从体液中分布到各个组织器官。给药5分钟后，组织药物浓度达血流高峰，在血流灌注丰富的器官分布较多，如肝脏、肾脏和肺等；尿样中未发现母体化合物，97％代谢产物经肾脏排出。在乙胺碘呋酮致仓鼠肺纤维化的模型中，按0.5％比例将PF掺入饲料给药，喂食3天后测得血浆PF浓度为2.04±1.81μg·ml^-1（n=3）。在肺匀浆中测得PF浓度为4.73±0.77μg·g^-1组织（n=3）。DOCA致高血压大鼠心肌纤维化模型予以PF治疗的研究中，对照组单次静脉注射PF 200 mg·kg^-1，消除半衰期为37min，该剂量口服的生物利用度为25.7％；以0.4％掺入食物中喂食14天，测得末次给药后24小时的血浆PF浓度为1.9±0.1μg·ml^-1。本项工作旨在进行该药临床前药代动力学研究，揭示吡非尼酮在动物体内的处置规律，阐明该药在大鼠和犬体内的吸收、分布、代谢、排泄、血浆蛋白结合率及对肝脏药酶活性的影响，为该药临床前安全性和有效性评价提供药代动力学依据。第一部分吡非尼酮的药物代谢动力学研究新药吡非尼酮（Pirfenidone，PF）的主要药效学实验结果显示，该药具有良好的抗肺纤维化作用。吡非尼酮的抗肺纤维化作用在国际上亦得到广泛研究。该药的研究与开发对有效防治肺纤维化病变具有重要意义。本项工作采用SD大鼠及beagle犬进行该药的药代动力学研究工作，揭示其在二种动物体内的处置规律，为该药的进一步临床应用提供依据。第一节吡非尼酮的药动学特征SD大鼠和Beagle犬PF药物动力学试验表明，静注吡非尼酮后，其血药浓度—时间数据经房室模型拟合，均符合二室开放模型，其分布相t_1／2α分别为（6.83±3.66）min和（6.23±5.44）min，提示该药自中央室向周边室分布迅速；消除相t_1／2β分别为（109.20±98.46）min和（49.77±14.09）min，提示该药消除过程亦较迅速。大鼠单次剂量静脉给予PF 50 mg·kg^-1后，其它药动学参数为：C_max45.10±15.34mg·L^-1，t_1／2β 109±98.46 min，AUC_0→300min 1706±494 mg·min·L^-1，AUMC_0-300min 121252±30141 mg·min²·L^-1，MRT_0-300min 67.14±17.07min。Beagle犬单次剂量静脉给予PF 18 mg·kg^-1后，其它药代动力学参数分别为：C_max22.62±6.99mg·L^-1，t_1／2β 49.77±14.09 min，AUC_0→480min 882±203 mg·min·L^-1，AUMC_0-480min 60801±11437 mg·min²·L^-1，MRT_0-480min 69.65±5.62 min。SD大鼠和Beagle犬灌胃给予吡非尼酮后，其血药浓度-时间过程均符合一室开放模型。大鼠给予PF低、中剂量时T_max为17min左右；犬给予PF低剂量时T_max为15min左右，中、高剂量时为33min，均说明该药口服吸收迅速。大鼠灌胃给予PF 25 mg·kg^-1、50 mg·kg^-1时，其半衰期为60min左右，给予100mg·kg^-1时为70min左右；而犬给予PF高、中、低三个剂量的半衰期均为50min左右，皆提示该药口服给药后自血液消除较迅速。SD大鼠分别灌胃给予PF 25、50、100和450 mg·kg^-1后，各组药物代谢动力学参数分别为：C_max 6.24±2.71 mg·L^-1、8.56±2.31 mg·L^-1、23.06±8.03 mg·L^-1和85.67±12.01mg·L^-1；T_max 21.00±8.22 min、17±7.58 min、27.00±6.71min和48.00±16.43min；t_1／2 60.61±23.66min、58.89±28.17min、73.71±31.13min和543±128min：AUC_0→300min 535±143mg·min·L^-1、880±315mg·min·L^-1、2842±870mg·min·L^-1和16200±3304mg·min·L^-1；AUMC_0-300min 47383±14074、81034±45743、278143±91690和2181900±575867mg·min²·L^-1；MRT_0-300min 88.06±12.27、88.46±21.38、97.22±15.71和133±15.41min。Beagle犬分别灌胃给予PF18、36、100mg·kg^-1后，各组药代动力学参数分别为：C_max 11.71±2.92mg·L^-1、20.22±4.86mg·L^-1、47.08±12.79mg·L^-1；T_max 15.00±5.48min、31.67±11.25min和33.33±9.83min；t_1／2分别为40.75±23.13min、49.46±13.55min和46.80±21.40min；AUC_0→480min 711±205mg·min·L^-1、1456±458mg·min·L^-1和4038±1114mg·min·L^-1；AUMC_0-480min 71343±20083、119340±49042、和342761±149413mg·min²·L^-1；MRT_0-480min分别为100.77±10.11、81.44±20.26和84.24±18.26min。PF在两种动物的绝对生物利用度分别为51.59％和80.59％。犬对该药的绝对生物利用度似高于大鼠。提示该药体内吸收和消除可能存在种属差异。PF在剂量范围为25mg·kg^-1至100mg·kg^-1时，C_max的增高和AUC的增大与剂量增加呈线性关系。当PF剂量为450mg·kg^-1时，剂量增加18倍，而AUC增加近30倍，呈非线性药代动力学特征，提示PF高剂量给予时，其药酶代谢可能已呈饱和状态。第二节吡非尼酮在大鼠体内组织分布研究大鼠按100mg·kg^-1剂量灌胃给予PF后，分别于10、60、150min处死。样品经HPLC法检测组织PF浓度。结果表明，大鼠给药后PF在各组织中均有分布，其中尤以胃肠道及血流丰富的组织，如脾、肝、心、肾、肺等组织中浓度较高。PF在脑中亦有较高分布，说明该药能透过血脑屏障。第三节吡非尼酮在大鼠体内排泄研究大鼠灌胃给予PF后，经与空白尿样比较，尿中未发现PF原形，而主要以代谢物M1、M2形式从尿中排泄；经与空白粪便样比较，粪便中仅发现痕量PF原形，该药主要以二种代谢物形式排泄；经与空白胆汁比较，胆汁中亦发现痕量PF原形，亦发现代谢物M1和少量的M2。初步的试验结果表明，PF主要以代谢物的形式从尿中排泄。另有少量代谢物及痕量的原形从粪便及胆汁中排泄。由于无代谢物对照品，尚未作定量检测。第四节吡非尼酮血浆蛋白结合率试验本实验采用平衡透析法研究吡非尼酮血浆蛋白结合率，并进行人和大鼠PF血浆蛋白结合率的比较。用高效液相色谱法测定平衡透析膜两侧的PF药物浓度，透析膜一侧为空白血浆，另外一侧为含PF 2 mg·L^-1、20mg·L^-1、100mg·L^-1药物浓度的NaH₂PO₄缓冲液，平衡时间为24小时。在2 mg·L^-1～100 mg·L^-1PF浓度范围内，PF人血浆蛋白结合率分别为77.78％、71.67％、66.19％，PF大鼠血浆蛋白结合率分别为64.09％、84.92％、84.27％。第二部分吡非尼酮对大鼠肝细胞色素P450酶活性的影响第一节吡非尼酮对大鼠P450酶总酶活性的影响采用差示光谱法测定微粒体混悬液蛋白中细胞色素P450含量。SD大鼠48只，随机分成空白组、肝药酶诱导剂组、肝药酶抑制剂组，吡非尼酮低剂量组、吡非尼酮中剂量组和吡非尼酮高剂量组。空白组给予1％CMC-Na，诱导剂组地塞米松100 mg·kg^-1，抑制剂组酮康唑40 mg·kg^-1，PF低、中、高剂量组分别为PF 25 mg·kg^-1，50 mg·kg^-1和100 mg·kg^-1灌胃给药，一日一次，连续6日。取大鼠的肝脏制备肝微粒体，测定肝微粒体中的蛋白浓度，用分光光度计对样品进行比色。结果表明，该药在中剂量组(50 mg·kg^-1)和高剂量组(100 mg·kg^-1)的P450含量与空白组比较有显著性差异（P＜0.01），提示该药在较大剂量时对肝药酶有诱导作用。第二节吡非尼酮对CYP3A及CYP2E1的影响作用采用Nash-甲醛形成法（Nash比色法）来研究吡非尼酮对大鼠CYP3A及CYP2E的影响，配制0.5ml反应液，加入NADPH生成系统启动反应，37℃水浴20min后，加入20％ZnSO₄ 0.05ml终止反应，混匀后每管再加入饱和Ba（OH）₂0.05ml，2500g离心15～20min，将0.35ml上清液转移至另一试管中，加入0.15mlNash试剂，混匀后加入50℃水浴温孵30min，冷却后在412nm测定样品光密度值。结果表明，在给药6d和12d后，吡非尼酮对大鼠肝微粒体NDMA酶（反映CYP2E1）的活性影响不显著（P＞0.05）；而吡非尼酮对大鼠肝微粒体ERD酶（反映CYP3A）具有显著的诱导作用（P＜0.01）并有明显的时间依赖性。第三部分吡非尼酮的代谢产物研究第一节吡非尼酮的主要代谢产物及代谢途径用LC-MS／MS法首次检测出大鼠及健康受试者口服PF后，在尿样及胆汁样中存在微量原形及10种代谢产物。其中M1为PF的5位甲基羟基化产物，M2为M1的羟甲基进一步氧化为羧酸的产物，M3、M4为二羟基化产物，M5、M6和M7为在二羟基化产物的基础上，5位羟甲基不稳定，进一步氧化为羧酸的产物，M7、M8和M9为代谢物M1、M2与葡萄糖醛酸结合形成的二相代谢产物。上述代谢物文献中均未见报道。大鼠口服PF后，在体内迅速代谢，其代谢物分别从胆汁及尿中排除体外，其中尿为主要排泄形式。尿中M2含量最高，为主要的代谢产物，其次为M1。文献报道吡非尼酮在小鼠体内代谢迅速且完全，尿样中未发现母体化合物。本试验亦证明PF在大鼠体内代谢迅速，但尿中仍检测到痕量原形化合物，说明吡非尼酮虽代谢迅速但不完全。大鼠口服PF后，其原形及代谢物均广泛分布于各组织中。通过对其靶器官肺组织的LC—MS检测，发现准分子离子为m／z 202和216的化合物，其质谱图与尿中M1和M2相同，故可推定为PF的醇化产物和羧酸化产物。健康受试者口服PF后，其原形及代谢物亦主要随尿排泄。尿中代谢物M2含量最高，为主要的代谢产物。在人尿中代谢物M1相对含量低于大鼠，而二相代谢产物的相对含量要高于大鼠。人尿中未检测到准分子离子为m／z 232的三个代谢物M5、M6、M7。根据检测结果可以推断，吡非尼酮在大鼠及健康受试者体内的主要代谢途径为：吡非尼酮吡啶环上的5位甲基先氧化为醇成为PF羟基化产物M1，M1的羟甲基进而氧化为羧酸M2。M1、M2再与葡萄糖醛酸结合后产生二相代谢产物M7、M8和M9而排出体外。其次还产生少量的二羟基化产物M3，M4。第二节吡非尼酮的主要代谢产物M2的结构确定20只大鼠灌胃口服PF 100 mg·kg^-1后1h，心室采血，收集血浆，样品经提取后用半制备色谱柱分离，收集M2流份，经减压干燥、醋酸乙酯萃取、适量去离子水洗三次后，减压除去溶剂，用于纯度鉴定及结构鉴定。分离提纯后的吡非尼酮主要代谢产物M2经HPLC纯度鉴定为97.2％。经UV、IR、MS和NMR综合解析，M2的结构确证为PF原型吡啶环上的5位甲基氧化为羧基的羧酸化产物。