近年来,由于新生儿重症监护技术的发展,早产儿存活率明显提升。但由于早产肺发育不成熟,易患呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome,RDS)、支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)等肺发育相关疾病,严重影响了早产儿的预后和生存质量。RDS是因缺乏肺表面活性物质所致,目前临床采用产前预防性应用糖皮质激素和外源性肺表面活性物质替代治疗等措施,RDS的治愈率明显提高;但对于难治型RDS,传统方法治疗效果欠佳、病死率高。BPD则由发育不成熟的肺遭受损伤后异常修复所致,是婴幼儿期慢性呼吸系统疾病的主要原因之一。因此深入研究RDS、BPD发病机制可能为疾病防治及药物研发提供重要干预靶点。Ⅱ型肺泡上皮细胞(type Ⅱ alveolar epithelial cell,AECII)不仅是肺上皮行使功能的重要细胞,且是各种损伤因子作用的靶点。AECII合成、分泌肺表面活性物质是肺成熟的必要环节,在降低肺泡表面张力、维持肺的顺应性、防止呼吸窘迫综合征的发生中发挥重要作用。此外AECⅡ作为Ⅰ型肺泡上皮细胞(type Ⅰalveolar epithelial cell,AECI)的祖细胞,自胚胎24周就开始分化产生AECI,以增加肺的囊-肺泡表面比例,为气体交换做准备;而成熟肺因各种致病因子导致AECⅠ损伤时,AECII则可增殖、分化成AECI,修复损伤的肺上皮。目前对于AECⅡ功能的研究因缺乏理想细胞株而受限,主要靠原代培养。原代培养的AECⅡ在72小时后会自动转分化为AECI,因而是研究AECⅡ转分化的天然细胞模型,但不适合AECⅡ功能的长期研究。MicroRNAs(miRNAs)是一种短链非编码调控RNA,通过调控靶向mRNA的功能发挥转录后调控的作用,广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导等生理过程和炎症反应、肿瘤发生等病理过程。miRNA-26a(miR-26a)是本课题组在前期研究肺发育过程中筛选出的差异表达miRNA,随后的生物信息学分析发现其潜在靶基因SMAD1和SMAD4与肺发育密切相关。我们将miR-26a过表达后发现:SMAD1、SP-B、SP-C的表达均下调。为进一步验证miR-26a的功能我们进行了如下研究。本课题研究分为两部分:第一部分以SD大鼠作为实验动物,探讨肺发育不同时期AECⅡ的原代培养,为后续研究提供细胞模型。第二部分以孕19天SD大鼠胎鼠AECⅡ为细胞模型研究过表达miR-26a在胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化过程中的作用及机制。第一部分 肺发育不同时期Ⅱ型肺泡上皮细胞的原代培养目的:探索肺发育不同时期AECⅡ原代培养方法,为研究肺发育提供细胞模型。方法:采用胰酶联合胶原酶消化孕19天(E19)、孕21天(E21)SD大鼠胎鼠肺组织,差速离心和差速贴壁进行纯化。Dispase酶或胰酶消化出生当天(P0)、生后3天(P3)、生后7天(P7)和生后14天(P14)SD大鼠的肺组织,差速贴壁、IgG免疫吸附法或percoll梯度离心法进行纯化。倒置相差显微镜观察细胞形态。用台盼兰染色法鉴定细胞的活力,免疫荧光鉴定细胞的纯度。结果:1.对于胎鼠AECⅡ的分离纯化,胰酶联合胶原酶消化、差速离心+差速贴壁法纯化就能达到预期结果。2.E19胎鼠AECⅡ原代分离纯化结果最理想,细胞量为(38.0±3.2)×106个/5只胎鼠,细胞活力为(95.0±2.1)%,纯度达到90%以上。3.E21胎鼠AECⅡ的细胞量为(50.5±2.1)×106个/5只胎鼠,活力是(93.5±1.5)%,纯度75%-80%左右。4.对于新生SD大鼠,胰酶联合胶原酶原代分离纯化的效果明显下降,随着日龄的增加,原代提取细胞的数量、活力和纯度急剧下降,P0、P3、P7、P14SD大鼠中,AECⅡ的纯度分别只有65%左右、40%左右、30%左右和30%左右。5.改进实验技术后,尝试Dispase酶消化、大鼠IgG免疫吸附、percoll梯度离心法纯化,细胞纯度只提高了 10%左右。结论:1.AECⅡ原代培养的细胞数及纯化程度与SD大鼠日龄呈负相关,E19胎鼠的AECⅡ最易于纯化,并且分离出来的细胞活力好、纯度高。2.随着肺的发育,AECⅡ分离纯化的难度增大。特别是对于生后SD大鼠的肺组织,单纯胰酶联合胶原酶消化、差速离心+差速贴壁的方法很难达到理想结果。因此出生后肺发育过程中AECⅡ的原代培养需要继续探索新方法。第二部分 过表达miRNA-26a对胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化的影响及其机制研究目的:探讨miR-26a在胎鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化过程中的作用及其可能机制。方法:采用胰酶联合胶原酶消化E19胎鼠肺组织,差速离心和差速贴壁法纯化AECⅡ,免疫荧光法检测细胞纯度。首先检测miR-26a在肺组织和AECⅡ的表达情况。在倒置相差显微镜下观察AECⅡ体外培养第1天(D1)、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)的形态变化,检测AECⅡ特异性蛋白ATP结合盒转运蛋白 A3(ATP binding cassette transporter A3,ABCA3)和 T1α(I 型肺泡上皮细胞的标志物)在此时间点的表达变化,real-time PCR技术检测miR-26a的表达情况。随后应用miR-26a过表达腺病毒和阴性对照病毒于培养24h时分别感染AECⅡ。在体外培养第4天时,依据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达量判断腺病毒的感染效率,利用real-time PCR技术验证AECII中miR-26a的过表达情况。免疫荧光技术检测T1α及ABCA3的表达。分别用real-time PCR技术和western blot技术检测T1α mRNA和蛋白的表达量。用western blot检测其潜在靶基因SMAD1和SMAD4(骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路中重要的下游分子)在转分化过程中的表达变化。结果:1.MiR-26a在肺组织和原代分离的AECⅡ中表达无显著差异。2.AECⅡ在体外培养过程中逐渐拉长,变扁平,失去AECⅡ的形态,同时AECⅡ特征性蛋白ABCA3的表达量逐渐下调,AECⅠ标志蛋白T1α逐渐增加,证明其向AECⅠ转分化。3.体外培养D1、D3、D5、D7时AECⅡ中miR-26a的表达量逐渐下调。4.MiR-26a过表达腺病毒感染AECⅡ 72h(AECⅡ体外培养第4天),95%的细胞均表达GFP,real-timePCR结果显示miR-26a显著过表达。5.在AECⅡ体外培养第4天时,免疫荧光结果显示miR-26a过表达组中T1α的表达量较对照组显著下调,而ABCA3的表达量显著上调。同时miR-26a过表达组中T1α mRNA和蛋白的表达量均较对照组显著下调,提示miR-26a抑制AECⅡ转分化。6.通过对AECⅡ转分化机制的进一步研究发现:miR-26a的潜在靶基因SMAD1在转分化过程中逐渐下调,而SMAD4的表达量无显著变化。结论:MiR-26a可抑制AECⅡ转分化,此过程可能是通过调节其潜在靶基因SMAD1、SMAD4所介导的Smad信号通路实现的,为进一步研究BPD及肺损伤修复机制提供依据。