目的获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的一种严重传染病。人类免疫缺陷病毒(HIV)主要侵犯免疫系统的CD4+T淋巴细胞,造成机体免疫功能下降,最终因患各种机会性感染或肿瘤而死亡。研究表明,在HIV感染过程中,天然免疫和获得性免疫系统一方面受到病毒感染的损害,细胞数量和功能发生变化,另一方面依旧发挥抗病毒的功能,抑制病毒复制。自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)是天然免疫系统中的重要效应细胞,在控制肿瘤和微生物感染中发挥重要作用。NK细胞不需要预先的致敏作用,就能溶解病毒感染细胞和恶性肿瘤细胞,产生多种细胞因子和趋化因子,限制感染并协助获得性免疫的应答。迄今为止,国际上关于NKG2家族受体的报道主要集中于单一受体表达的研究,而很少对两种不同作用的受体或者多种受体在同一NK细胞表面表达进行研究,那么NKG2A和NKG2C是否会同时表达在一个NK细胞表面,还是只表达NKG2A不表达NKG2C或只表达NKG2C不表达NKG2A呢?以往此类的研究未见报道。单独研究一种受体只能片面反映NK细胞的功能,所以只有对抑制性受体和活化性受体同时进行检测,才更有利于反映出不同类型NK细胞在HIV感染后的变化和作用。中国人群的遗传特征和HIV流行毒株也与欧美人群不同,因此对中国人群NK细胞表面NKG2A和NKG2C表达同时进行研究非常重要。此外,HIV慢性感染者NK细胞表面NKG2A和NKG2C的表达偶见报道,那么在原发感染者中表达情况又如何呢?而且HIV原发感染病例很难得到,目前对HIV原发感染者研究NK细胞表面NKG2A和NKG2C的组合表达国际上尚无报道。由于NK细胞作为机体抗肿瘤和感染的第一道防线,在获得性免疫应答之前就发挥免疫作用来保护机体。在HIV原发感染阶段获得性免疫还没有完全建立,主要依靠天然免疫特别是NK细胞发挥保护作用。因此利用原发感染队列研究NK细胞表面受体表达和细胞功能具有重要的科学意义。本研究以原发感染HIV的男男同性恋人群为主,应用多色流式细胞分析技术,对NK细胞表面抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2C的表达进行研究。方法1、研究对象22例HIV原发感染(primary HIV infection, PHI)者来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊,均为男性,年龄分布为21-53岁(33±10),感染的亚型以CRF01_AE为主,入选标准为满足以下一项或多项条件：①在6个月内HIV抗体阳转者；②HIV抗体阴性但HIV RNA阳性者；③HIV抗体弱阳性但在两周之内可以重复并OD值较前次升高者；④有早期HIV感染的临床症状、HIV抗原阳性及WB抗体检测少于4条蛋白带者。23例HIV抗体阴性的健康对照(HIV-negative normal control, NC),均为男性,年龄分布为22-60岁(31±8),符合以下标准：HIV抗体阴性,血常规及肝功正常,乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性,无免疫系统疾病。Fiebig分期是早期HIV感染的分期系统,我们根据Fiebig分期系统估计HIV原发感染者的感染时间。2、CD4+T细胞绝对值的检测将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光15min,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光15min,应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测,MultiSET软件分析结果,得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。3、NK细胞各亚群NKG2A、NKG2C的检测每人设计两管,一管为同型对照,一管为染色管,在染色管中加入荧光抗体组合CD3-FITC/CD16-Percp-Cy5.5/CD56-PE-Cy7/NKG2A-PE/NKG2C-APC,再加入100μl混匀的抗凝全血,室温避光30min。加入自配溶血素3ml,室温避光8 min,离心,300g,5min,弃上清。混匀,加入3ml鞘液重悬,离心,300g,5min,弃上清。再混匀,加入3ml鞘液重悬,离心,300g,5min,弃上清。混匀后加入含1%多聚甲醛的固定液200μl重悬,应用FACSAria流式细胞仪进行检测,BDFACSDivaTM软件分析结果。4、HIV病毒载量测定以500μl血浆采用标准版模板制备法提取RNA,采用Roche公司HIV-1Monitor 1.5试剂盒在COBAS AMPLICOR自动载量仪上以RT-PCR方法测定病毒载量。5、统计学分析应用SPSS11.5软件包进行统计分析,所有数据以中位数表示,两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P<0.05为有统计学意义。结果一、HIV原发感染者不同感染时间NKG2A、NKG2C表达情况我们选取感染时间6个月内的HIV原发感染者,根据感染时间不同将其分成两组,分别是感染3个月组16例和感染6个月组13例,对HIV原发感染者感染3个月、6个月时NK细胞亚群和受体表达情况进行研究。(一)NK细胞亚群构成情况结果显示：与HIV抗体阴性健康对照相比,CD56dimCD16+NK细胞的百分率在感染3个月组和感染6个月组均显著降低(P=0.014,P=0.040);CD56-CD16+NK细胞的百分率在感染3个月组和感染6个月组均显著升高(P=0.001,P=0.001)；CD56briCD16+/-NK细胞的百分率在感染6个月组显著降低(P=0.017)。(二)NK细胞各亚群NKG2A、NKG2C的表达情况本研究应用荧光抗体CD3-FITC、CD16-Percp-Cy5.5、CD56-PE-Cy7. NKG2A-PE和NKG2C-APC,对各亚群NK细胞表面抑制性受体和活化性受体进行检测,分析NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平。1、总NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平(1)单独分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A的表达水平在各组间比较均无显著性差异。NKG2C的表达水平在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.010,P=0.005)。(2)同时分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A+NKG2C-细胞的百分率在感染6个月组显著低于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.022)。NKG2C+NKG2A-细胞的百分率在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.002,P=0.002)。NKG2A+NKG2C+细胞的百分率在各组间比较均无显著性差异。2、CD56dimCD16+NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平(1)单独分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A的表达水平在各组间比较均无显著性差异。NKG2C的表达水平在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.003,P=0.001)。(2)同时分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A+NKG2C-细胞的百分率在感染6个月组显著低于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.023)。NKG2C+NKG2A-细胞的百分率在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.002,P=0.003)。NKG2A+NKG2C+细胞的百分率在各组间比较均无显著性差异。3. CD56-CD16+NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平(1)单独分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A的表达水平在各组间比较均无显著性差异。NKG2C的表达水平在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.001,P=0.001)。(2)同时分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A+NKG2C-细胞的百分率在各组间比较均无显著性差异。NKG2C+NKG2A-细胞的百分率在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.001,P=0.001)。NKG2A+NKG2C+细胞的百分率在感染6个月组显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.028)。4、CD56briCD16+/-NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平(1)单独分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A的表达水平在感染3个月组和感染6个月组均显著低于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.043,P=0.043)。NKG2C的表达水平在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.009,P=0.002)。(2)同时分析NKG2A、NKG2C的表达水平：NKG2A+NKG2C-细胞的百分率在感染6个月组显著低于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.009)。NKG2C+NKG2A-细胞的百分率在感染3个月组和感染6个月组均显著高于HIV抗体阴性健康对照组(P=0.000,P=0.001)。NKG2A+NKG2C+细胞的百分率在各组间比较均无显著性差异。二、HIV原发感染者NK细胞表面NKG2A、NKG2C表达的动态变化对本实验室检测的感染时间6个月内的HIV原发感染者NK细胞表面抑制性受体NKG2A和活化性受体NKG2C的表达随感染时间的动态变化进行了描述。1、NK细胞表面NKG2A、NKG2C单独表达的动态变化NKG2A在CD56briCD16+/-NK细胞表面的表达水平随感染时间的延长有降低趋势,在总NK细胞及其它亚群NK细胞表面的表达水平随感染时间的延长无明显变化。NKG2C在总NK细胞和各亚群NK细胞表面的表达水平随感染时间的延长均有升高趋势。2、NK细胞表面NKG2A、NKG2C组合表达的变化趋势NKG2A+NKG2C-在总NK细胞和各亚群NK细胞表面的表达水平随感染时间的延长有降低趋势。NKG2C+NKG2A-、NKG2A+NKG2C+在总NK细胞和各亚群NK细胞表面的表达水平均随感染时间的延长有升高趋势。三、病毒调定点(set point)不同的HIV原发感染者NKG2A、NKG2C表达的变化情况我们选取感染时间120天内的HIV原发感染者,根据病毒调定点(定义为感染时间120天以后第一次采样时检测的病毒载量,以lg(v1)表示)高低不同将其分成两组,分别是低病毒调定点组(low:lg(vl)<4) 8例和高病毒调定点组(high:lg(vl)>4)8例,比较两组NK细胞亚群构成和受体表达情况(表1)。1、总NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平NKG2A+和NKG2A+NKG2C-细胞的百分率在低病毒调定点组显著低于高病毒调定点组(P=0.021,P=0.036)。NKG2C+NKG2A-细胞的百分率在低病毒调定点组显著高于高病毒调定点组(P=0.021)。2、CD56dimCD16+NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达水平NKG2A+细胞的百分率在低病毒调定点组显著低于高病毒调定点组(P=0.027)。NKG2C+NKG2A-细胞的百分率在低病毒调定点组显著高于高病毒调定点组(P=0.021)。四、HIV原发感染者免疫、病毒等指标的相关性分析我们选取感染时间120天内的HIV原发感染者,分析其免疫、病毒等指标的相关性。1、总NK细胞NKG2A、NKG2C表达与病毒载量的相关性分析NKG2A+和NKG2A+NKG2C-细胞水平都与病毒载量正相关(R=0.650,P=0.002; R=0.457, P=0.043)。NKG2C+NKG2A-细胞水平与病毒载量负相关(R=-0.567,P=0.009)。2、CD56dimCD16+NK细胞NKG2A、NKG2C表达与病毒载量的相关性分析NKG2A+和NKG2A+NKG2C-细胞水平都与病毒载量正相关(R=0.697,P=0.001; R=0.499, P=0.025)。NKG2C+NKG2A-细胞水平与病毒载量负相关(R=-0.595,P=0.006)。3、NK细胞不同亚群NKG2A、NKG2C表达的相关性在总NK细胞中：NKG2A+细胞水平与NKG2C+细胞水平负相关(R=-0.676,P=0.001), NKG2A+NKG2C-细胞水平与NKG2C+NKG2A-细胞水平负相关(R=-0.829,P=0.000)。在CD56dimCD16+NK细胞中受体相关性同前(R=-0.624,P=0.003;R=-0.796,P=0.000)。结论1、单独分析HIV原发感染者总NK细胞表面NKG2A的表达,各组无差异。同时分析NKG2A、NKG2C的表达, NKG2A+NKG2C-在总NK细胞和各亚群NK细胞表面表达下降,表明同时检测NKG2A、NKG2C以及分析不同NK细胞亚群,才能真正反映NK细胞在HIV感染后的变化。2、与HIV抗体阴性的健康对照相比,HIV原发感染者NKG2A+NKG2C-NK细胞的百分率降低,NKG2C+NK细胞和NKG2C+NKG2A-NK细胞的百分率升高,提示NK细胞接收到的活化信号增多,活性增强,发挥杀伤作用。3、HIV原发感染者低病毒调定点组NKG2A+NK细胞、NKG2A+NKG2C-NK细胞的百分率低,NKG2C+NKG2A-NK细胞的百分率高,提示NKG2A低表达NKG2C高表达使NK细胞功能活性增强,在感染早期抑制病毒复制,影响病毒调定点。4、NKG2A+NK细胞水平与病毒载量正相关,与NKG2C+NK细胞水平负相关,同时NKG2C+NKG2A-NK细胞水平与病毒载量负相关,与NKG2A+NKG2C-NK细胞水平负相关。NK细胞表面NKG2A、NKG2C的表达是研究疾病进展的指标之一。