结合珠蛋白(Haptoglobin, Hp)是急性期蛋白的一种,主要在肝脏中合成代谢。Hp的浓度在动物机体发生病理损伤24 h至48 h后就会迅速升高,在组织恢复健康以后又会迅速降低至正常。其主要功能是与游离的Hb结合,进而避免血红蛋白中铁离子的流失。近年来的大量研究表明,血清中Hp含量的测定可以为动物的健康状况和猪肉质量的评价提供参考依据。根据GenBank上公布的野猪hp基因序列设计引物,应用PCR技术获得hp基因片断,构建重组表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,通过纯化及复性后得到纯度高、免疫活性好的重组蛋白GST-Hp和His-Hp,并分别以它们为免疫原和检测原,制备出抗猪Hp的多克隆抗体和单克隆抗体,并初步应用于免疫学研究。1、提取梅山猪肝脏总RNA, RT-PCR获得cDNA, PCR扩增获得细基因片断,回收后连接到pMD18-T,对所得到的重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析及序列测定,与GenBank序列号为AF492467的野猪hp基因片段序列进行BLAST比对,同源性达99.52%；将目的基因与pGEX-KG和pET-32a(+)载体连接构建重组质粒,并成功在大肠杆菌中进行了表达,SDS-PAGE电泳结果显示,分别出现了分子量约为59.5 Ku和52.2 Ku的蛋白条带,与预期融合蛋白GST-Hp和His-Hp的分子量大小一致。2、采用双筛选的方法,即用GST-Hp免疫BALB/c小鼠,用His-Hp和GST蛋白进行筛选,获得3株高效分泌猪Hp单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为384、3C8和1F10,3B4和3C8腹水效价均为1：1.024×106,1F10效价稍差。Western-blot和间接ELISA检测均表明制备的单克隆抗体具有良好的特异性。3、采用GST-Hp为免疫原,His-Hp为检测原,按照设计好的免疫程序,制备兔抗Hp的高免血清,抗体效价为1：1.6×104,并对所得高免血清采用辛酸-硫酸铵法进行纯化,最后得到了纯化的兔抗猪Hp的IgG。4、采用过碘酸钠法,用辣根过氧化物酶(HRP)标记3B4,然后以3C8为捕获抗体,以HRP-3B4为检测抗体,初步建立猪Hp夹心ELISA检测方法,绘制标准曲线,对数据进行回归分析,得到回归方程y=0.9312×1g(Hp浓度(ng/mL))-1.8212,该方法最低检测限为0.139μg/mL,最适检测范围为0.139～15μg/mL。以3B4为一抗,采用SABC法进行Hp的免疫组化,初步研究了Hp在猪各器官组织中的分布,结果证实了Hp主要在肝脏合成,可能通过血液循环运送到其他脏器。