第一部分DH豚鼠原发性膝骨关节炎模型的实验研究目的：探讨Dunkin Hartley(DH)豚鼠原发性骨性关节炎的发生及其特点，对不同月龄的DH豚鼠不同原发osteoarthritis(OA)阶段关节软骨大体改变、关节软骨结构、组织化学成分的变化进行动态观察，了解软骨组织病理变化，为后续试验提供科学可用的OA原发模型。方法：32只雌性1月龄DH豚鼠随机分为4组，各组动物分别在1月龄、3月龄、6月龄、9月龄时处死，打开膝关节腔后，观察各组豚鼠膝关节软骨面并拍照记录。后腿去皮及肌肉组织，避免损伤膝关节，切取胫骨到股骨之间的关节软骨组织后，70％酒精固定豚鼠股骨，固定72小时后用EDTA-2Na制成脱钙液行脱钙处理，约8周后骨组织变软，钙盐彻底脱失后行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明并进行石蜡包埋切片，将厚度约为6-8gm的骨组织石蜡切片行Masson染色，用于关节软骨组织形态学观察，采用Mankin评分方法定量分析关节软骨损伤情况；另取部分关节软骨标本立即按程序制成电镜标本行扫描电镜观察软骨面改变情况及透射电镜观察软骨细胞改变情况。采用免疫组化方法检测各组大鼠膝关节软骨中蛋白多糖（glycosaminoglycans, GAG）、基质金属蛋白酶-3(matrixmetalloproteinase-3, MMP-3）表达情况，应用Image pro-Plus6.0软件对免疫组化阳性蛋白表达情况进行积分光密度(integrated optical density, IOD）计算，定量分析各组大鼠膝关节软骨阳性细胞表达差异。采用ELISA法测量不同月份豚鼠血清中雌二醇的含量，进行统计分析。结果：1各组DH豚鼠体重变化随着月龄的增高，豚鼠体重逐渐升高，与前一月龄比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。2不同月龄DH豚鼠膝关节软骨表面大体观察发现：1月龄组豚鼠膝关节软骨面光滑完整；而随着月龄的增长，3月龄时观察可见豚鼠膝关节软骨面晦涩，偶见关节面轻度破溃；6月龄时关节面晦涩加重，破溃面积增大；9月龄时破溃面积明显增大，周围可见较小骨赘形成。3关节软骨Masson染色形态学观察发现：1月龄组豚鼠关节软骨面完整，软骨层厚，软骨与软骨下骨界限清晰，基质着色均匀，细胞有序排列；3月龄组关节软骨面较完整，软骨略薄，软骨与软骨下骨界限较清晰，基质着色局部不一致，细胞排列出现簇集现象；6月龄组关节软骨面完整性欠佳，软骨更薄浅，软骨与软骨下骨界限模糊，中层部分失染，细胞数量减少，簇集现象较重；9月龄组关节软骨面完整性更差，软骨变薄明显，软骨与软骨下骨界限模糊不清，基质着色不均，软骨细胞变形坏死，且排列紊乱，深层有增殖细胞团生成。4关节软骨Mankin评分显示：随着DH豚鼠月龄增高，Mankin评分也不断升高，各组之间评分统计均有显著差异，具有统计学意义(P<0.05)。5扫描电镜结果：1月龄组软骨面光滑，似覆盖一层无定形物质，典型的垄形结构平行，无胶原暴露。3月龄组部分软骨表面无定形物质有所缺失，偶见圆形突起，部分暴露表层胶原纤维，排列较不规则，可见流水冲蚀样改变。6月龄组部分胶原纤维网增粗、断裂、剥脱样改变,圆形突起较3月龄组增多。部分软骨面垄形结构完全消失，表面粗糙，见散在凹塌，凹塌为缺失的表面软骨细胞所在。9月龄组软骨面胶原集合成粗枝状并翻起，裂缝中可见胶原纤维，凹塌样改变增多，软骨表面正常结构消失。6透射电镜结果：1月龄组分布在表层及深层的软骨细胞大多呈梭形或椭圆形，细胞结构、轮廓清晰，胞质内有丰富的线粒体、高尔基复合体和粗面内质网，且结构清晰。细胞外见纵横交错的胶原纤维，表层胶原纤维多与表面平行，深层多与软骨下骨垂直，不具明显横纹。3月龄组细胞基本清晰，少见不规则形，核膜基本清晰，染色质分布在核周边，部分细胞质结构不清，偶见粗面内质网肿胀。6月龄组细胞较不清晰，不规则形增多，核膜较不清晰，部分细胞质结构不清，可见粗面内质网肿胀，胞质中可见钙结晶体，胶原纤维部分增粗。9月龄组细胞不清晰且不规则，核膜不清晰，胞质结构不清，有大量钙结晶体，粗面内质网肿胀，胶原纤维增粗，出现明显横纹。7关节软骨免疫组化检测显示：随着DH豚鼠月龄增高，豚鼠软骨中GAG表达1月与3月间表达无明显差异，6月开始起显著降低，比较具有统计学差异（P<0.05)；MMP-3表达3月开始显著升高，各组之间评分统计均有显著差异，具有统计学意义（P<0.05)。8随着DH豚鼠月龄的升高，血清中雌二醇含量呈增高趋势，1月至3月，3月至6月升高明显，有统计学意义（P<0.05)，6月至9月雌二醇含量变化较平稳，无明显改变（P>0.05)。结论：雌性DH豚鼠随着月龄的增长，膝关节软骨发生了退行性变，且病变程度岁月龄增长而加重。 DH豚鼠作为一种原发性的OA动物模型，其发生过程与人OA的形成具有一定的相似之处，因此可以利用此模型来探讨OA发生的病因和机制。第二部分甲状旁腺激素1-34对豚鼠原发性膝骨关节炎潜在的保护作用目的：探讨早期应用甲状旁腺激素1-34（Parathyroid Hormone (1-34)，PTH(1-34)）干预对DH豚鼠原发性膝骨关节炎模型的保护作用。方法：48只雌性1月龄DH豚鼠随机分为6组，其中2组为给药组，在3月龄时开始给予PTH(1-34)皮下注射干预（15μg/kg/d，每周5天），分别干预3个月和6个月。在1月龄、3月龄、6月龄、9月龄时处死各组动物，打开膝关节腔后，观察各组豚鼠膝关节软骨面并拍照记录。后腿去皮及肌肉组织，避免损伤膝关节，切取胫骨到股骨之间的关节软骨组织后，70％酒精固定豚鼠股骨，固定72小时后用EDTA-2Na制成脱钙液行脱钙处理，约8周后待钙盐彻底脱失骨组织变软后行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明并进行石蜡包埋切片，将厚度约为6-8gm的骨组织石蜡切片行Masson染色，用于关节软骨组织形态学观察，采用Mankin评分方法定量分析关节软骨损伤情况；采用免疫组化方法检测各组大鼠膝关节软骨中II型胶原（Type-II Collagen）、金属基质蛋白酶-13（matrix metalloproteinases-13,MMP-13）、骨硬化蛋白（sclerostin,SOST）表达情况，应用Image pro-Plus6.0软件对免疫组化阳性蛋白表达情况进行积分光密度(integrated optical density, IOD）计算，定量分析各组大鼠膝关节软骨阳性细胞表达差异。结果：1不同月龄DH豚鼠膝关节软骨表面大体观察发现：1月龄组豚鼠膝关节软骨面光滑完整；而随着月龄的增长，3月龄时观察可见豚鼠膝关节软骨面晦涩，偶见关节面轻度破溃；6月龄时关节面晦涩加重，破溃面积增大；9月龄时破溃面积明显增大，周围可见较小骨赘形成。6月PTH(1-34)给药组关节面破溃程度较轻，与3月龄组相仿；9月PTH(1-34)给药组关节面破溃程度较相同月龄对照组轻，且小骨赘形成较少。2关节软骨Masson染色形态学观察发现：1月龄组豚鼠关节软骨面完整，软骨厚，软骨与软骨下骨界限清晰，基质着色均匀一致，细胞排列有序；3月龄组关节软骨面较完整，软骨略薄，软骨与软骨下骨界限较清晰，基质着色局部不一致，细胞排列出现簇集现象；6月龄组关节软骨面完整性欠佳，软骨更薄浅，软骨与软骨下骨界限模糊，中层部分失染，细胞数量减少，簇集现象较重；6月PTH(1-34)给药组关节软骨面较完整，软骨厚度较相同月份对照组厚，基质着色较均匀，入骨细胞形态、排列均有所改善；9月龄组关节软骨面完整性更差，软骨变薄明显，软骨与软骨下骨界限模糊不清，基质着色不均，软骨细胞变形坏死，且排列紊乱，深层有增殖细胞团生成。9月PTH(1-34)给药组无论在软骨面完整性、软骨厚度、细胞形态、排列方面均较相同月龄对照组有改善。3关节软骨Mankin评分显示：随着DH豚鼠月龄增高，Mankin评分也不断升高，各组之间评分统计均有显著差异，具有统计学意义（P<0.05)。PTH(1-34)能显著降低Mankin评分，各给药组与同期对照组相比均有显著性差异（P<0.05)。4关节软骨免疫组化检测显示：随着DH豚鼠月龄增高，豚鼠软骨II型胶原表达显著降低，MMP-13与SOST显著升高，各组之间统计均有显著差异，具有统计学意义（P<0.05)。与同月龄对照组比较，PTH(1-34)能显著升高II型胶原表达，降低MMP-13与SOST的表达，各给药组与同期对照组相比均有显著性差异（P<0.05)。结论：在DH豚鼠原发性骨关节炎动物模型中，早期应用PTH(1-34)皮下注射能够刺激软骨细胞II型胶原合成，提高II型胶原表达，并降低MMP-13与SOST的表达，延缓DH豚鼠原发性膝关节软骨退变。第三部分甲状旁腺激素1-34对豚鼠原发性膝骨关节炎的作用机制目的：PTH(1-34)在软骨和骨调控中起重要作用，目前它作为一种治疗OA的潜在药物受到关注。本实验在DH豚鼠原发性骨关节炎动物模型基础上，早期给予PTH(1-34)进行干预，观察PTH(1-34)对豚鼠膝关节软骨及软骨下骨相关因子及骨组织形态结构的影响，初步探讨其作用机制。方法：48只雌性1月龄DH豚鼠随机分为6组，其中2组为给药组,在3月龄时开始给予PTH(1-34)皮下注射干预（15μg/kg/d，每周5天），分别干预3个月和6个月。在1月龄、3月龄、6月龄、9月龄时处死各组动物。后腿去皮及肌肉组织，避免损伤膝关节，采集的左右胫骨髁软骨下骨行Micro-CT检测，检测之后的远端标本放入4%多聚甲醛中固定72小时以上，用EDTA-2Na制成脱钙液行脱钙处理，约8-10周后骨组织变软待钙盐彻底脱失后行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明并行石蜡包埋切片,将厚度约为6-8gm的骨组织石蜡切片分别行免疫组化检测各组豚鼠膝关节软骨及软骨下骨中骨保护素（osteoprotegerin, OPG）、核因子κB受体活化因子配基（receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL）、甲状旁腺激素受体（Parathyroid hormone-related peptide,PTH1R）表达情况,并计算软骨及软骨下骨中OPG/RANKL的比值变化。应用Image pro-Plus6.0软件对免疫组化阳性蛋白表达情况行积分光密度(integrated opticaldensity, IOD）计算，定量分析各组大鼠膝关节软骨阳性细胞表达差异。对各组胫骨软骨下骨行Micro-CT检测，计算软骨下骨骨小梁结构数据：骨密度（BMD）、相对体积（bone volume/trabecular volume, BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁数量（trabecular number,Tb.N)、软骨下骨骨板厚度（Plate thickness, Pl.Th)及结构模型指数（Struc-ture Model Index, SMI），定量分析软骨下骨结构参数。结果：1关节软骨免疫组化检测显示：随着DH豚鼠月龄的增高，豚鼠软骨RANKL表达显著升高，OPG、PTH1R表达降低，各组之间统计均有显著差异，具有统计学意义（P<0.05)。与同期对照组比较，PTH(1-34)能显著降低MMP-13、SOST、RANKL的表达，升高OPG、PTH1R的表达，各给药组与同期对照组相比均有显著性差异（P<0.05)。2软骨下骨免疫组化检测显示：随着DH豚鼠月龄增高，豚鼠软骨下骨OPG、PTH1R表达降低，RANKL表达升高，各组之间统计均有显著差异，具有统计学意义（P<0.05)。与同期对照组比较，PTH(1-34)能显著升高软骨下骨OPG、PTH1R表达，降低RANKL表达，各给药组与同期对照组相比均有显著性差异（P<0.05)。3DH豚鼠软骨OPG/RANKL比值及软骨下骨OPG/RANKL比值均随月龄增高而降低，各组之间统计均有显著差异，具有统计学意义（P<0.05)。与同期对照组比较，PTH(1-34)能显著升高软骨及软骨下骨OPG/RANKL比值，各给药组与同月龄对照组相比均有显著性差异（P<0.05)。4Micro-CT检测软骨下骨示：随着月龄的增高，对照组软骨下骨BMD升高，较前一月龄组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05），6月给药组较相同月龄对照组BMD升高不明显，差异无统计学意义（P＞0.05），9月给药组较相同月龄对照组BMD升高明显，差异具有统计学意义（P<0.05）。对照组软骨下骨BV/TV在3月龄时升高明显，6月龄和9月龄时无明显变化，给药组较同月龄对照组能显著升高BV/TV值，差异有统计学意义（P<0.05）。Tb.Th及Pl.Th随月龄升高而升高，较前一月龄组比较均有统计学意义（P<0.05），给药组较同月龄对照组能显著降低Tb.Th及Pl.Th值，差异有统计学意义（P<0.05）。对照组SMI在1月龄和3月龄无显著差异，在6月龄和9月龄时降低明显，差异有统计学意义（P<0.05），9月给药组较同月龄对照组能显著升高SMI值，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：早期给予PTH(1-34)干预能通过降低RANKL在软骨及软骨下骨的表达，升高OPG、PTH1R在软骨及软骨下骨的表达，升高OPG/RANKL在软骨及软骨下骨的比值,改善软骨下骨骨小梁微观结构,维持软骨下骨生物力学性能发挥治疗OA的作用。