甲胺磷(O,S-二甲基硫代磷酰胺)是一种剧毒的有机磷类农药,由于较好的杀虫效果往往被违禁使用,危害严重,有必要进一步对其加强监测。免疫分析法具有灵敏、简便、快速等特点,在农药残留检测中具有突出的优势。目前虽有制备甲胺磷多克隆抗体和单克隆抗体的报道,但其抗体制备需进行动物免疫及昂贵的细胞培养设备,周期长,成本高。第三代抗体—重组抗体的出现为快速、低成本制备小分子化学农药抗体提供了新的途径。为此,本论文开展了抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建、筛选及抗甲胺磷单链抗体的表达与特性研究,主要研究内容及结果如下：1 Balb/c小鼠的免疫及抗血清特性初步分析利用活泼酯法将合成的甲胺磷半抗原β-(O,S-二甲基磷酰)氨基丙酸(HM3)与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联分别制备免疫原HM3-BSA和包被原HM3-OVA。将HM3-BSA按高(H)、中(M)、低(L)3个不同剂量组分别免疫Balb/c小鼠。抗血清分析结果表明,经过8次近6个月时间的免疫在高(H)剂量组中获得了1只良好免疫效果的H3号Balb/c小鼠。2抗体可变区基因的获得及抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的构建取H3号Balb/c免疫小鼠的脾细胞提取信使RNA(mRNA),通过反转录PCR (RT-PCR)扩增出了大小约340bp和320bp的抗体重(VH)、轻链(VL)可变区基因片段。纯化回收的VH与VL基因在接近等摩尔浓度下,首先采用含有Linker接头片段的引物利用重叠延伸拼接法(SOE-PCR)将VH与VL基因片段组装成单链抗体(ScFv)基因片段,再用带有限制性内切酶位点的引物(5’端SfiⅠ,3’端NotⅠ)扩增含内切酶位点的ScFv基因,获得了大小约750bp的目的片段,纯化回收并分别用SfiⅠ和NotⅠ酶切消化后,与经SfiⅠ、NotⅠ双酶切过的噬菌粒载体pCANTAB5E连接,电转化大肠杆菌E.coli TG1,建成了库容约9.8×105的抗甲胺磷噬菌体单链抗体库。经对随机转化子质粒的PCR及HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定,该抗体库重组率高。BstNⅠ酶切图谱显示该噬菌体单链抗体库具有良好的多样性。3抗甲胺磷噬菌体单链抗体库的筛选和鉴定借助辅助噬菌体M13K07的超感染,扩建了滴度约1.75×1013pfu/mL的抗甲胺磷噬菌体-ScFv表面展示文库。通过降低抗原包被浓度和增强洗脱力度的方法,以包被原HM3-OVA对展示库进行了五轮“吸附、洗脱、扩增”的富集筛选,结果显示,从第三轮开始,噬菌体回收率、多克隆噬菌体ELISA的OD值及阳性率均呈现上升趋势。从第5轮筛选后得到的细菌集落中分批随机挑选大量单克隆,经单克隆噬菌体ELISA及竞争ELISA进一步筛选鉴定,获得了6个特异性较强的抗甲胺磷噬菌体单链抗体阳性克隆,基因序列分析及Blast数据库检索表明所得6个阳性克隆的序列互不相同,均符合鼠源单链可变区抗体基因的结构和特征。4抗甲胺磷单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达及性质鉴定将6个甲胺磷噬菌体阳性克隆提取噬菌粒分别转化琥珀终止非抑制型大肠杆菌E.coli HB2151, IPTG诱导过夜小量制备各克隆的可溶性单链抗体。收集细菌沉淀及培养上清,采用渗透休克法提取菌体细胞周质中的可溶性单链抗体,并对培养上清进行超滤浓缩。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,周质腔提取物及浓缩上清在分子量约30KD处明显出现一增粗条带,与单链抗体的预期分子量相符,而阴性对照菌中没有该条带。间接ELISA结果显示,6个克隆的细菌培养上清和周质腔提取物中的抗体均能与包被抗原反应,说明分泌型单链抗体得到了正确的折叠和表达。间接竞争ELISA初步分析6个克隆新鲜制备的周质腔提取物对游离甲胺磷的竞争抑制性,结果显示,6个克隆的表达产物对游离甲胺磷均具有不同程度的抑制作用,其中克隆Met-93的周质腔提取物抑制中浓度I50值最高(887.66μg/mL),克隆Met-28D4的周质腔提取物I50值最低(146.74μg/mL)。以抗体表达的最优化条件对Met-28D4阳性克隆株进行摇瓶发酵(1L)大量制备纯化单链抗体,抗体产量约0.98 mg/L培养基。以纯化单链抗体为免疫试剂,初步建立了甲胺磷竞争ELISA分析法。该ELISA标准曲线的线性范围为1～500μg/mL, I50为118.69μg/mL,检出限120为3.36μg/mL;在该线性范围内,标准曲线的批内和批间变异系数分别为2.3%和4.8%,稻谷和小白菜样品中添加甲胺磷后的平均回收率分别为83.8%和87.0%。交叉反应结果显示,本研究制备的纯化Met-28D4单链抗体仅与乙酰甲胺磷有部分交叉反应(4.9%),而与供试的其它5种有机磷农药(敌敌畏、乐果、甲拌磷、甲基对硫磷和水胺硫磷)的交叉反应率均小于0.1%,表明所制备的纯化单链抗体对甲胺磷的识别是高度特异的。抗体稳定性试验结果表明,在蛋白保护剂存在条件下,4℃保存下的纯化单链抗体其结合活性可维持约6-7周的时间,基本能满足短期内单链抗体研究的需要,但在大规模生产、应用等方面,就显得稳定性不够。5抗甲胺磷单链抗体在巴斯德毕赤酵母中的表达及性质鉴定在巴斯德毕赤酵母P. pastoris (X-33)中分泌表达Met-28D4-ScFv。设计引物从Met-28D4-pCANTAB5E-ScFv上扩增Met-28D4-ScFv,亚克隆至P. pastoris表达载体pPICZαC,获得酵母表达质粒pPICZαC-ScFv。表达质粒pPICZαC-ScFv线形化后,电转化P.pastoris (X-33)。随机挑选转化子菌落进行PCR鉴定,结果显示,转化子的酵母染色体中均整合有外源ScFv基因。在抗性梯度筛选多拷贝整合菌株试验中,共获得5个在2000μg/mL ZeocinTM的YPDS选择平板上正常生长的菌落,表型鉴定结果均为甲醇利用快速型(Mut+)。对5个多拷贝Mut+型转化菌进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE结果显示,各菌株诱导48 h后在约30KD处均可见明显条带,72 h处表达量最大,各菌株表达量之间无明显差异；间接ELISA结果显示,各菌株诱导72h的表达产物具有较好的抗原结合活性。选其中一个稳定高表达的X-33-Pp-Met-28D4-1菌株进行优化诱导表达试验,优化后的条件为：本实验室30℃、250 rpm的振荡培养条件下,菌体接种量OD600nm =1.5,培养基pH值6.5,每24 h补加甲醇至终浓度1.00%,诱导时间72 h。经过优化条件下的诱导表达,单链抗体的表达量达25 mg/L,比Invitrogen公司推荐的诱导表达条件下的表达量高5 mg/L。对优化条件下的诱导表达产物进行纯化并进行竞争ELISA初步试验,结果表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体与游离甲胺磷具有较好的抗原结合特异性,其I50为93.52μg/mL,与大肠杆菌表达的单链抗体的性质基本接近；交叉反应结果显示,酵母表达纯化单链抗体与乙酰甲胺磷的交叉反应率为3.8%,与其它农药的交叉反应率均小于0.1%。稳定性试验表明,酵母表达纯化抗甲胺磷单链抗体的稳定性比大肠杆菌表达的单链抗体的稳定性有了一定的提高。本论文研究结果为甲胺磷特异性抗体的大量制备奠定了一定的基础,对开发其它小分子化学农药的重组抗体具有重要的理论价值和实践意义。