论文部分内容阅读
前言患者,特别是老年患者在围手术期可能出现以注意力不能集中,语言理解力下降,认知能力减退和重返术前生活状态困难为主要特点的临床表现,这一类的临床表现在1998年被命名为术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction,POCD),201 8年被更新为围术期神经认知障碍(perioperative neurocognitive disorders,PND)。虽然本研究研究的内容是术后短时间内发生的神经认知功能障碍,符合传统意义上的POCD的概念,也有学者建议对此类研究内容应使用术后神经认知障碍的名称。但根据专家的共识,为了规范和便于叙述,除第一章因实验开展较早,尚无PND的概念,因此继续沿用POCD的名称外,其他部分均使用PND这一名称。PND的发生机制目前尚不明确,可能的机制包括中枢神经系统的炎症,氧化应激反应导致的中枢损伤,中枢胆碱能系统功能的降低,β淀粉样蛋白(amyloid β-protein,Aβ)积聚和tau蛋白的过度磷酸化。有研究认为:手术引起的围手术期代谢产物的改变,可能是导致PND的潜在因素。本研究拟通过代谢组学的方法鉴别全麻下接受胃肠道恶性肿瘤腔镜手术的早期POCD老年患者血清中差异表达的代谢产物以期找到POCD的潜在标志物并对POCD的发生机制进行探索。根据发现的潜在标志物,采取针对性的干预手段,通过行脾脏切除术的老年大鼠模型,观察干预手段是否可以改善老年大鼠PND并探索其作用机制,为临床上预防和改善PND提供参考。第一章老年患者早期术后认知功能障碍的血清代谢组学研究目的:采用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra Performance Liquid Chromatography and Q-TOF Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)的代谢组学方法,分析鉴别全麻下接受胃肠道恶性肿瘤腔镜手术的早期POCD患者血清中差异表达的代谢产物。识别早期POCD的血清学标志并探讨POCD的发病机制。材料与方法:选择择期行接受胃肠道恶性肿瘤腹腔镜手术的患者40例,年龄65岁以上,手术前简易智力状态检查量表(Mini-mental State Examination,MMSE)评分不低于23分。患者均接受气管插管全身麻醉,围手术期管理均遵循加速康复外科(enhanced recovery after surgery,ERAS)的要求。术前1天和术后第7天分别进行MMSE和蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment,MoCA)。将患者根据MoCA评分分为两组。POCD组:MoCA评分≤24;非POCD组:MoCA评分>24。最后,有20名接受胃肠道恶性肿瘤腹腔镜手术的患者被判定为POCD,POCD的发生率为50%。术后于神经心理测试当天(术后第7天)采集静脉血2mL。血清代谢物谱分析使用Agilent 1290 Infinity液相色谱仪和Agilent 6538精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪,采用偏最小二乘判别分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)模型的 VIP(Variable Importance in the Projection)值(阈值>1.0),并结合t检验的p值(p<0.05)在单因素分析水平上来寻找差异性表达代谢物。在识别潜在标志物时,使用了以下数据库:HMDB(http://www.hmdb.ca/),METLIN(http://metlin.scripps.edu/index.php)。通路分析和网络使用 IPA software(IPA,Ingenuity(?)Systems,http://www.ingenuity.com)。潜在标志物的特异性和敏感性由 MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)提供的受试者工作特性曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲线下面积来评定。结果:POCD组的血清中有40种代谢产物被发现与非POCD组相比有显著改变,这些不同的代谢产物主要是脂肪酸、脂类、肉碱衍生物。受试者工作特征曲线分析表明磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)(17:2/0:0),其曲线下面积为0.966,是POCD诊断和预后的潜在敏感和特异性生物标志物。以POCD与非POCD之间的差异代谢产物为基础构建网络,最重要的通路包括一氧化氮(nitric oxide,NO)信号、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号、线粒体功能障碍和核转录因子-κB(nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB)信号。结论:建立了一种基于UPLC-Q-TOF-MS的血清代谢组学方法对POCD组血清的整体代谢变化进行研究的途径,POCD组代谢途径的扰动被呈现。40种不同的代谢产物被确定,分析显示脂肪酸代谢、脂质代谢和肉碱代谢在POCD中显著改变。发现磷脂酰丝氨酸(17:2/0:0),有0.966的ROC曲线下面积,是诊断POCD的潜在生物标志物。IPA分析表明:NO信号、PI3K-AKT信号、mTOR信号,线粒体功能障碍和NF-κB信号与POCD的发病机制有关。第二章磷脂酰丝氨酸干预对脾脏切除术后老年大鼠围术期神经认知障碍和海马组织氧化应激的影响目的:探讨磷脂酰丝氨酸干预是否通过抑制脾脏切除术后老年大鼠海马组织氧化应激而改善围术期神经认知障碍。材料与方法:清洁级雄性老年Sprague-Dawley(SD)大鼠80只,体重:380～420g,月龄:18个月及以上。大鼠按随机原则分为以下4组:对照组(C组,n=20,常规饲养30天);麻醉组:(A组,n=20,常规饲养30天后大鼠腹腔注射异丙酚10mg/100g麻醉后复苏);手术组:(S组,n=20,常规饲养30天后大鼠腹腔注射异丙酚1Omg/100g麻醉后行脾脏切除);PS干预组:(PS组,n=20,常规饲养并灌胃给药99%磷脂酰丝氨酸50mg/kg*天30天后大鼠腹腔注射异丙酚10mg/100g麻醉后行脾脏切除)。各组在术前进行每天4次,连续5天的Morris水迷宫训练,第6天按相关分组进行麻醉或手术处理。术后第3天各组随机选择10只大鼠并在术后第7天将各组剩余的10只大鼠分别进行定位航行实验和空间探索实验,在实验后麻醉下处死取海马组织,对大鼠海马的含水量、ATP含量(adenosine triphosphate,ATP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛malondialdehyde,MDA)含量、NO含量、Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶活性进行检测;术后第7天进行海马组织的电镜下观察。结果:Morris水迷宫测试显示术后第3天S组大鼠潜伏期时长较C组、A组上升;PS组大鼠潜伏期时长较S组降低,较C组、A组上升。术后第7天S组大鼠潜伏期时长较C组、A组上升;PS组大鼠潜伏期时长较S组降低。术后第3,7天S组大鼠平台穿越次数较C组、A组降低;PS组大鼠平台穿越次数较S组上升。术后第3天S组大鼠海马含水量较C组、A组上升;PS组大鼠海马含水量较S组降低。术后第7天S组大鼠海马含水量较C组、A组上升。术后第3,7天S组大鼠海马ATP含量较C组、A组降低;PS组大鼠海马ATP含量较S组上升,较C组、A组降低。术后第3天S组大鼠海马SOD活性较C组、A组降低;PS组大鼠海马SOD活性较S组上升,较C组、A组降低。术后第7天S组大鼠海马SOD活性较C组、A组降低。术后第3,7天S组大鼠海马MDA含量较C组、A组上升;PS组大鼠海马MDA含量较S组降低,较C组、A组上升。术后第3,7天S组大鼠海马NO含量较C组、A组上升;PS组大鼠海马NO含量较S组降低,较A组、C组上升。术后第3,7天S组大鼠海马Na+K+ATPase活性和Ca2+Mg2+ATPase活性较C组、A组降低;PS组大鼠海马Na+K+ATPase活性和Ca2+Mg2+ATPase活性较S组上升,较C组、A组降低。术后第7天电镜下S组大鼠海马出现胞浆内内质网扩张,部分线粒体肿胀有空泡,突触泡扩张;神经元细胞核染色质聚集;PS组大鼠海马胞浆内线粒体肿胀减轻,内质网扩张,神经元细胞核核染色质分布较为均匀。结论:老年大鼠接受脾脏切除术后第3,7天的认知功能下降并伴有海马组织氧化应激反应,术前给予磷脂酰丝氨酸干预可以部分改善认知功能并降低海马组织氧化应激反应的程度。第三章磷脂酰丝氨酸干预对脾脏切除术后老年大鼠海马小胶质细胞活化,血脑屏障通透性和海马神经元凋亡的影响目的:探讨磷脂酰丝氨酸干预是否通过抑制脾脏切除术后老年大鼠M1型小胶质细胞活化降低血脑屏障通透性减少海马神经细胞的凋亡。材料与方法:清洁级雄性老年SD大鼠80只,体重:380～420g,月龄:18个月及以上。大鼠按随机原则分为以下4组:对照组(C组,n=20,常规饲养30天);麻醉组:(A组,n=20,常规饲养30天后大鼠腹腔注射异丙酚10mg/100g麻醉后复苏);手术组:(S组,n=20,常规饲养30天后大鼠腹腔注射异丙酚10mg/100g麻醉后行脾脏切除);PS干预组:(PS组,n=20,常规饲养并灌胃给药99%磷脂酰丝氨酸50mg/kg*天30天后大鼠腹腔注射异丙酚10mg/100g麻醉后行脾脏切除)。术后第3天各组随机选择10只大鼠并在术后第7天将各组剩余的10只大鼠分别腹腔内注射异丙酚10mg/100g进行麻醉后处死取海马,检测小胶质细胞活化相关的炎症因子,血脑屏障对伊文思蓝(Evans blue,EB)的通透性以及紧密连接复合体中的闭锁小带蛋白1(zona occludens-1,ZO-1)、闭合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白(claudin)的蛋白表达并利用流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)检测海马神经细胞的凋亡。结果:术后第3天S组大鼠海马中的IL-6水平较C组、A组上升;PS组的IL-6水平较S组下降,较C组、A组上升。术后第7天S组大鼠海马中的IL-6水平较C组、A组上升;PS组的IL-6水平较S组下降。术后第3,7天S组大鼠海马中的IL-1B水平较C组、A组上升;PS组的IL-1B水平较S组下降。术后第3天S组大鼠海马中的IL-4水平较C组、A组下降;PS组的IL-4水平较S组上升。术后第3,7天S组大鼠海马中的IL-10水平较C组、A组下降;PS组的IL-10水平较S组上升。术后第3天S组大鼠海马中的EB渗出量较C组、A组上升;PS组的EB渗出量较S组下降,较C组、A组上升。术后第7天S组大鼠海马中的EB渗出量较C组、A组上升;PS组的EB渗出量较S组下降。术后第3天S组大鼠海马中的ZO-1、occludin表达水平较C组、A组下降;PS组的ZO-1、occludin表达水平较S组上升,较C组、A组下降。术后第7天S组大鼠海马中的ZO-1、occludin表达水平较C组、A组下降;PS组的ZO-1、occludin表达水平较S组上升。术后第3,7天S组大鼠海马凋亡神经细胞比例较C组、A组上升;PS组大鼠海马凋亡神经细胞比例较S组降低,较C组、A组上升。结论:老年大鼠接受脾脏切除术后第3,7天海马中M1型小胶质细胞活化相关的炎症因子上升,M2型小胶质细胞活化相关的炎症因子降低;血脑屏障通透性上升,ZO-1、occludin表达下降并伴有海马凋亡神经细胞比例上升。术前给予磷脂酰丝氨酸干预可以升高术后第3,7天海马中M2型小胶质细胞活化相关的炎症因子,降低M1型小胶质细胞活化相关的炎症因子,部分抑制血脑屏障通透性升高,升高ZO-1、occludin表达并降低海马凋亡神经细胞比例。