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能源危机和全球气候变暖，导致人们迫切需要低成本的可再生能源。目前，木质纤维素被认为可以用来生产生物燃料。成功利用木质纤维素生产乙醇取决于对生物质水解的六碳糖和五碳糖的高效转化。已有大量关于工程酵母利用木糖发酵乙醇的报道，但是和葡萄糖发酵相比，这些菌株对木糖的利用效率以及乙醇的产量相当低。因此，对酿酒酵母进行遗传改良进行高效木糖发酵，很有必要。 本研究中克隆了酵母木糖发酵途径中的关键基因XYL1，XYL2和XKS1，构建到组成型表达载体pPYPGE15，并成功转化到Ura3营养缺陷型酿酒酵母PY001中。对得到的酿酒酵母转化子进行酶活性的测定，酵母生长量以及木糖发酵产物测定等实验。比较了XYL1和XYL2不同表达顺序、融合表达XYL1-XYL2时酶活性的差异以及其对利用木糖发酵乙醇效率的影响。 实验结果显示，优先转录XYL1的菌株PY001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1在所有时间段均表现出XYL1酶活性高于PY001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1，在培养48h时达到最高峰为0.027U/mg。优先表达XYL2的菌株PY001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1表现出最高的XYL2的酶活性，在培养48h达到1.64U/mg。可以推断基因在载体的转录顺序会影响蛋白水平的表达，优先转录的基因表达量较高。 使用连接肽(G4S1)1融合表达XYL1和XYL2蛋白时，酶活性均无明显提高，使用连接肽(G4S1)3时，XYL1的活性与对照菌株相比无明显变化，而XYL2的活性提高了11倍左右。说明在融合表达XYL1-XYL2时，XYL1肽段的结构发生了改变，而XYL2肽段活性不受影响。 以1％木糖为唯一碳源进行限氧发酵时，PY001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1和PY001/pYPGE15XYL2XYL1XKS1可以利用木糖进行缓慢生长，在培养72h后OD/600nm达到0.95左右，但乙醇产量太低而无法检测。以1％木糖和2％葡萄糖为底物进行共发酵，PY001/pYPGE15XYL1XYL2XKS1对木糖利用率约45.6％。发酵进行到96h乙醇浓度约为2.0％，比对照菌株PY001/pPYPGE15提高了20％。