【摘 要】
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目的:通过DNA条形码生物技术手段对淫羊藿的真伪进行鉴定,UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS结合多元统计分析技术对不同基原淫羊藿的化学成分差异,并探究淫羊藿对顺铂诱导的肾损伤的保护机制,为临床应用提供实验基础。方法:1.利用天根试剂盒提取叶片总DNA,对ITS2序列进行PCR扩展与测序,计算K2P遗传距离,构建系统发育树。2.采用UHPLC-Q Exactive Orbitr
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目的:通过DNA条形码生物技术手段对淫羊藿的真伪进行鉴定,UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS结合多元统计分析技术对不同基原淫羊藿的化学成分差异,并探究淫羊藿对顺铂诱导的肾损伤的保护机制,为临床应用提供实验基础。方法:1.利用天根试剂盒提取叶片总DNA,对ITS2序列进行PCR扩展与测序,计算K2P遗传距离,构建系统发育树。2.采用UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS和多变量统计分析。根据准确的质量信息、化合物的碎片化特征和保留时间,鉴定化学成分。其次,通过PCA和PLS-DA分析,筛选出可用于鉴别淫羊藿不同基原的化学标记物。最后进行定量分析,阐明不同基原淫羊藿标志物成分含量差异。3.借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)平台搜索淫羊藿化学成分,在人类基因综合数据库(Gene Card)数据库中搜索与肾损伤的相关基因,构建淫羊藿的化学成分-疾病靶点网络图、PPI(蛋白质蛋白质相互作用网络图);同时,应用DAVID进行KEGG(京都基因与基因百科全书)和GO(基因功能分析)富集分析更深入地探索作用机制。4.为检测网络药理学的预测结果是否与实际一致,因此,做体外细胞实验进行验证,培养HK-2细胞,分别用ELISA法检测SOD、MDA氧化水平影响;ROS检测淫羊藿提取物对活性氧的影响,JC-1检测其对线粒体膜电位的影响,Western blot检测细胞中p-NFκB、NFκB、IκBα、Bax、Bcl-2等蛋白表达。结果:1.通过DNA条形码生物技术鉴定5种基原淫羊藿为正品,但基原上存在混乱的问题。2.通过UHPLC-Q Exactive Orbitrap/MS结合数据库及相关文献,共鉴定出38个化学成分,其中通过正谱鉴定出12个、负谱鉴定出26个。利用多元统计分析,共鉴定差异化学成分14种,且发现不同基原的淫羊藿含量上存在差异。3.通过TCMSP数据库检索共获得130个化合物,经过筛选,纳入研究的活性成分共有23个。淫羊藿与肾损伤共同靶点63个。获取PPI网络图,该网络中包含63个节点,448条边,平均节度值为14.2,并列出前30关键节点,其中大于平均节度值有14个;将63个共同靶点进行富集分析,共获得4807个GO条目,生物途径389个,细胞组分3920个,分子功能498个。4.淫羊藿提取物降低丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平,同时使HK-2细胞中谷胱甘肽(GSH)水平增加,显著改善顺铂诱导的氧化应激。同时淫羊藿提取物可以使线粒体膜电位升高。使Bcl-2蛋白的表达水平有所升高。同时Bax、caspase-3、caspase-9蛋白的表达水平与模型组相比显著下降,NF-κB、IκBα蛋白表达量降低。结论:通过DNA条形码生物技术鉴定5种基原淫羊藿为正品,但基原上存在混乱的问题。5种不同基原淫羊藿化学成分存在差异,且含量也存在不规则的变化规律。淫羊藿是利用多成分、多靶点发挥保护作用,通过影响炎症、氧化应激对顺铂诱导的肾损伤起到保护作用,从而减少细胞凋亡。
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