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中药注射剂是我国独创的新剂型,一向被认为毒副作用小、比较安全而更受患者青睐,然而近年来的“鱼腥草注射液事件”、“刺五加注射液事件”以及“双黄连注射液事件”等一系列不良事件,引发了人们对中药注射剂安全性问题的疑虑和临床用药的信任危机。现在通常认为药物安全性评价内容主要包括药理学、化学、药物代谢和药物动力学、毒理学和一些风险因素。其中药动学药物相互作用由于可导致严重的药物不良反应,甚至死亡,至2001年就已导致特非那丁、米非地尔、溴芬酸、格帕沙星、息斯敏、西伐他汀等新药从市场撤出。因此,本研究以此为切入点构建评价中药注射剂药动学药物相互作用的体内外平台,研究临床常用中药注射剂对细胞色素P450(CYP450)和P-糖蛋白(P-gp)的作用,期望有助于优化临床给药方案,提高临床用药的有效性和安全性。本研究的主要研究内容包括:
第一部分8种中药注射剂药动学药物相互作用初筛
目的:研究8种中药注射剂对SD大鼠肝微粒体细胞色素P450的体外抑制作用。方法:在体外鼠肝微粒体孵育体系中加入CYP3A的特性性探针药物-睾酮和不同体积的中药注射剂,用HPLC法测定睾酮的羟化代谢产物6β-羟基睾酮的生成量反映CYP3A的活性,酮康唑用作阳性对照药。结果:金纳多注射液、疏血通注射液、参麦注射液、康艾注射液、舒血宁注射液对6β-羟基睾酮的生成无明显的抑制作用;灯盏细辛注射液、血塞通注射液、清开灵注射液则能明显地抑制6β-羟基睾酮的生成,它们的半数抑制浓度IC50和抑制常数Ki分别为0.40％和0.24％、1.00％和0.66％、0.87％和0.43％(体积百分比浓度),抑制类型均为混合型抑制。结论:金纳多注射液、疏血通注射液、参麦注射液、康艾注射液、舒血宁注射液对CYP3A无抑制作用;灯盏细辛注射液、血塞通注射液、清开灵注射液对CYP3A有抑制作用,临床合用时需注意与之相关的药物相互作用。
灯盏细辛注射液是由菊科植物灯盏细辛经提取酚酸类成分制成的灭菌水溶液,其主要成分为灯盏乙素和总咖啡酸酯等,具有活血祛瘀、通络止痛之功效,因此临床广范应用于治疗偏瘫和心脑血管疾病。由于处方和成分相对简单,因此以其为研究对象进行了下列深入研究。
第二部分灯盏细辛注射液的代谢性药物相互作用实验研究
1.灯盏细辛注射液对鼠CYP450酶6种亚型的体外抑制作用
目的:用“Cocktail”探针药物法,研究灯盏细辛注射液及其有效成分对SD大鼠微粒体CYP450酶6种亚型的体外抑制作用。方法:将CYP450酶的特异性探针非那西丁(CYP1A2)、紫杉醇(CYP2C8)、双氯芬酸(CYP2C9)、s-美芬妥因(CYP2C19)、右美沙芬(CYP2D6)、睾酮(CYP3A4)和咪达唑仑(CYP3A4)同时与鼠肝微粒体在体外进行孵化反应,采用LC-MS/MS法同时测定7个特异性探针药相对应的代谢产物(对乙酰氨基酚、6α-羟基紫杉醇、4-羟基双氯芬酸、4-羟基美芬妥因、右啡烷、6β-羟基睾酮和1-羟基咪达唑仑)的生成量反映相应酶型的活性,并选择6种CYP450酶的特异性抑制剂作为阳性对照药。结果:灯盏细辛注射液在鼠肝微粒体孵育体系中能明显抑制对乙酰氨基酚和6β-羟基睾酮的生成,Icso值分别为0.79％和1.49％,其次是6α-羟基紫杉醇、右啡烷、4-羟基双氯芬酸、1-羟基咪达唑仑和4-羟基美芬妥因;灯盏细辛提取物在鼠肝微粒体孵育体系中也能明显抑制对乙酰氨基酚的生成,Icso值为123μg/mL,其次是6α-羟基紫杉醇、4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬酸、右啡烷、6β-羟基睾酮和1-羟基咪达唑仑;灯盏乙素仅轻微地抑制6α-羟基紫杉醇和4-羟基美芬妥因的生成,Icso值分别为63.1μM和85.6μM;1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸对所有代谢产物的生成均无明显抑制,Icso值都超过了100μM。结论:灯盏细辛注射液对鼠CYP1A2抑制作用最强,其次是CYP3A4_T、CYP2C8、CYP2D6、CYP2C9、CYP3A4_M和CYP2C19;灯盏细辛提取物也是对鼠CYP1A2抑制作用最强,其次是CYP2C19、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4_T和CYP3A4_M;灯盏乙素仅对鼠CYP2C8和CYP2C19有弱的抑制作用;1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸对鼠CYP450酶6种亚型均无明显的抑制作用。本部分研究内容大部分为首次报道。
2.灯盏细辛注射液对人CYP450酶6种亚型的体外抑制作用
目的:用“Cocktail”探针药物法,研究灯盏细辛注射液及其有效成分对人肝微粒体CYP450酶6种亚型的体外抑制作用。方法:将CYP450酶的特异性探针非那西丁(CYP1A2)、紫杉醇(CYP2C8)、双氯芬酸(CYP2C9)、s-美芬妥因(CYP2C19)、右美沙芬(CYP2D6)、睾酮(CYP3A4)和咪达唑仑(CYP3A4)同时与人肝微粒体在体外进行孵化反应,采用LC-MS/MS法同时测定7个特异性探针药相对应的代谢产物(对乙酰氨基酚、6α-羟基紫杉醇、4-羟基双氯芬酸、4-羟基美芬妥因、右啡烷、6β-羟基睾酮和1-羟基咪达唑仑)的生成量反映相应酶型的活性,并选择6种CYP450酶的特异性抑制剂作为阳性对照药。结果:灯盏细辛注射液在人肝微粒体孵育体系中能明显抑制对乙酰氨基酚和6α-羟基紫杉醇的生成,Icso值分别为1.36％和1.51％,其次是4-羟基美芬妥因、4-羟基双氯芬酸、6β-羟基睾酮、右啡烷和1-羟基咪达唑仑;灯盏细辛提取物在人肝微粒体孵育体系中也能明显抑制对对乙酰氨基酚和6α-羟基紫杉醇的生成,Icso值为71μg/mL和143μg/mL,其次是1-羟基咪达唑仑、4-羟基美芬妥因、6β-羟基睾酮、右啡烷和4-羟基双氯芬酸;灯盏乙素仅轻微地抑制4-羟基美芬妥因的生成,IC50值为63.8μM:1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸对所有代谢产物的生成均无明显抑制,IC50值都超过了100μM。结论:灯盏细辛注射液对人CYP1A2和CYP2C8抑制作用最强,其次为CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4_T、CYP2D6和CYP3A4_M;灯盏细辛提取物对人CYP1A2和CYP2C8抑制作用最强,其次为CYP3A4_M、CYP2C19、CYP3A4_T、CYP2D6和CYP2C9;灯盏乙素仅对人CYP2C8和CYP2C19有弱的抑制作用;1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸对人CYP450酶6种亚型均无明显的抑制作用。本部分研究内容均为首次报道。
3.灯盏细辛注射液对SD大鼠体内CYP450酶5种亚型活性的影响
目的:采用“Cocktail”探针药物法研究灯盏细辛注射液对SD大鼠体内CYP450酶5种亚型活性的影响。方法:同时给予探针药咖啡因(CYP1A2)、甲苯磺丁脲(CYP2C9)、美托洛尔(CYP2D6)、氯唑沙宗(CYP2E1)、咪达唑仑(CYP3A4),用HPLC法测定高剂量组(0.72 mL/100g)、低剂量组(0.18 mL/100g)、长期用药(14d)和短期用药(3d)使用灯盏细辛注射液前后大鼠血浆中相应探针药的浓度,DAS2.0软件计算药动学参数,采用方差分析进行组间比较,Dunnetts检验进行实验组与对照组的主要药动学参数进行差异性比较。结果:静脉给予大鼠灯盏细辛注射液高剂量、低剂量、长期用药和短期用药后,与对照组相比,美托洛尔的AUC和t1/2显著高于对照组,CL显著低于对照组(P＜0.05);静脉给予大鼠灯盏细辛注射液高剂量、低剂量、长期用药和短期用药后,与用药前相比,基本上咪达唑仑的AUC、MRT和t1/2均显著高于对照组,CL显著低于对照组(P＜0.05);静脉给予大鼠灯盏细辛注射液高剂量、低剂量、长期用药和短期用药后,与用药前相比,咖啡因、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗的药代动力学参数均没有显著性变化。结论:灯盏细辛注射液对SD大鼠CYP2D6和CYP3A4的活性有抑制作用,对CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1的活性没有影响。本部分研究内容部分为首次报道。
第三部分灯盏细辛注射液对P-糖蛋白抑制作用的实验研究
目的:研究灯盏细辛注射液及其有效成分对P-gp的体外抑制作用。方法:以人转移性恶性黑色素瘤细胞(WM-266-4)为实验对象,在孵育体系中加入不同浓度的灯盏细辛注射液及其有效成分,用荧光扫描酶标仪测定Calcein-AM的荧光强度来反映其对P-gp的抑制作用。用维拉帕米作为阳性对照药。结果:用各浓度的灯盏细辛注射液、灯盏细辛提取物、灯盏乙素和1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸处理WM-266-4细胞后,Calcein-AM的荧光强度倍数的增长最高只有2％,影响无统计学意义。结论:灯盏细辛注射液、灯盏细辛提取物、灯盏乙素和1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸对P-gp均无明显的抑制作用。本部分研究内容均为首次报道。
本研究在结合了药物代谢酶和转运蛋白的理论基础上,首次初步建立了中药注射剂药动学相互作用的评价方法体系,为提高中药注射剂的安全性和有效性做出了有意的探索。其次,在此基础上,首次对灯盏细辛注射液的药动学相互作用进行了全面系统的研究,发现灯盏细辛注射液在联合用药时,可能会发生由CYP2D6和CYP3A4介导的代谢性药物相互作用,不会发生与转运蛋白P-gp相关的药物相互作用;且灯盏乙素和1,5-氧-二咖啡酰奎宁酸不是灯盏细辛注射液发挥对CYP2D6和CYP3A4抑制作用的有效成分。最后,本研究可为灯盏细辛注射液提供药物相互作用方面的基础研究数据,有助于填补该药药品说明书中[药物相互作用]的空白。由于使用灯盏细辛注射液的大多为老年患者,联合使用的药物类型更为广泛,而CYP2D6和CYP3A4可代谢约60％多的临床药物,临床应用时更需注意灯盏细辛注射液与经CYP2D6和CYP3A4代谢的药物合用,应考虑到可能存在的药动学药物相互作用带来的不良反应。