目的众所周知,肠道是大体最大的“储菌所”,在人体肠道内寄生着500-1000种共计100万亿个细菌(这些细菌影响着人的消化能力和免疫功能,对人体的健康非常重要)。其中的革兰氏阴性菌死亡的时候会释放内毒素,因此肠道也是人体最大的“内毒素库”。由肠源性内毒素引发的急性肝损伤是临床上导致肝脏功能衰竭的常见原因之一。LPS作为内毒素的主要成分,通过腹腔注射到小鼠体内,能够很好的模拟肠源性内毒素发生感染的过程,而D-GalN能够特异性的消耗肝脏内的UTP,从而抑制相应的核酸、蛋白质等物质的合成,最终导致肝细胞的损伤甚至死亡。LPS与D-GalN的联合注射能够特异性的造成肝脏的暴发性衰竭,是研究急性肝损伤的很好的动物模型。自噬是一种在所有真核细胞中都稳定存在的,以一种双分子膜包裹着细胞质成分成为自噬体,随后这些结构和溶酶体融合,递送的“货物”被降解和回收的过程,是对发育、分化、生存以及稳态起重要作用的胞内途径。在过去的十多年中,其在人类疾病中的作用被广泛关注。最近数据表明自噬参与多种肝脏疾病的发生。然而关于自噬在急性肝损伤中的作用的报道却很少而且结果也不一致。渥曼青霉素是一种自绳状青霉中分离出来的抗真菌类抗生素,它没有抗细菌能力,只特异性地作用于真菌。很多文献报道渥曼青霉素能够在体内外抑制自噬。本课题的目的是拟探讨LPS/D-GalN诱导急性肝损伤中肝组织坏死、凋亡及自噬的改变及采用渥曼青霉素预处理对LPS/D-GalN诱导急性肝损伤中肝组织坏死、凋亡及自噬的影响。通过本研究的完成,不仅可以进一步阐明LPS/D-GalN诱导小鼠发生急性肝损伤的分子机制,还可以为开发临床上治疗肠源性内毒素引发的急性肝损伤的药物提供借鉴价值。方法一、脂多糖/D半乳糖胺诱导小鼠的急性肝损伤情况利用脂多糖/D-半乳糖胺腹腔注射到野生型C57BL/6小鼠体内,建立小鼠的急性肝损伤内毒素诱导模型,在诱导3小时以及5小时后处死小鼠,收集血清、肝组织进行后续指标的测定。1.利用医用全自动生化分析仪器对各小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平进行检测。2.采用苏木素伊红(HE)染色方法对肝组织切片进行病理学检测,并利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定(TUNEL)检测肝组织的凋亡情况。3.采用免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC)和免疫蛋白印迹(western blot)方法检测肝组织中caspase-3的活化水平。二、脂多糖/D半乳糖胺诱导急性肝损伤过程中肝组织自噬水平的变化1.采用免疫蛋白印迹方法检测肝脏自噬标志物LC3B-II的表达水平变化。2.采用免疫组织荧光染色方法检测肝脏中自噬小体形成的变化情况。三、脂多糖/D-半乳糖胺诱导急性肝损伤过程中炎性细胞因子的分泌情况1.利用BD公司开发的基于流式细胞仪的液相蛋白定量技术(BDTMCytometric Bead Array (CBA) System)对血清中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10等炎性细胞因子的含量进行检测,另采用酶联免疫吸附方法对血清中IL-1p的含量进行检测。2.采用RT-PCR方法对肝脏组织中以上各种炎性细胞因子(Tnfa、Mcp1、I11β、 I16、I110)的mRNA表达水平进行检测。四、渥曼青霉素预处理对小鼠急性肝损伤以及肝组织中炎性细胞因子分泌的影响在注射脂多糖/D-半乳糖胺前1小时,将渥曼青霉素以同样的方式注射到小鼠体内,然后再注射脂多糖/D-半乳糖胺诱导肝损伤,然后在诱导5小时后,处死小鼠,收集血清、肝组织再进行后续相关指标的测定。1.测定小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量,统计分析渥曼青霉素对小鼠肝脏功能的影响。2.苏木素伊红染色检测肝脏组织的病理学损伤,并同样进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定,来探究渥曼青霉素对肝细胞坏死和凋亡的影响。3.免疫组织化学染色和免疫蛋白印迹检测分析肝组织中caspase-3活化水平受渥曼青霉素的影响。4. RT-PCR检测肝脏中以上各种炎性细胞因子的mRNA水平变化,以明确渥曼青霉素对肝组织中炎性细胞因子分泌的影响。五、渥曼青霉素预处理对肝组织自噬水平的影响1.免疫蛋白印迹检测自噬标志物LC3B-Ⅱ的表达变化,以探究渥曼青霉素对肝脏中自噬水平的影响。2.免疫组织荧光染色检测分析渥曼青霉素对肝脏中自噬小体形成的影响。六、渥曼青霉素预处理对肝组织中MAPI及NF-κB信号通路活化的影响1.采用免疫蛋白印迹方法对肝脏内MAPK通路中ERK、JNK、p38的活化情况即磷酸化水平进行检测。2.采用免疫蛋白印迹方法对肝脏内NF-κB通路中p65的活化情况即磷酸化水平进行检测。结果一、脂多糖/D-半乳糖胺能诱导小鼠的急性肝损伤,造成肝组织的坏死和凋亡1.小鼠血清中的谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量,在被诱导肝损伤3小时后并没有变化,但在诱导5小时后明显升高。2.小鼠的肝组织,在被诱导损伤3小时后开始出现少量的炎性细胞浸润和充血,而在诱导5小时后出现大量的炎性细胞浸润并伴有严重的充血。3.肝脏内TUNEL阳性细胞,在被诱导损伤3小时后有少量出现,但在诱导5小时后明显增多；另外caspase-3在被诱导3小时后没有活化,但在诱导5小时后明显活化。二、在脂多糖/D-半乳糖胺导致小鼠急性肝损伤过程中肝组织中的自噬水平升高1.小鼠肝脏内LC3B-Ⅱ的表达在被诱导损伤3小时后没有变化,但在诱导5小时后明显升高。2.肝脏内自噬小体在被诱导损伤3小时后就已经开始形成,在诱导5小时后,形成明显增多。三、在脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤中炎性细胞因子分泌增加1.小鼠血清中TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10等炎性细胞因子的水平在被诱导肝损伤3小时以及5小时后均明显升高。2.小鼠肝脏中Tnfa、Mcp1、I11β、I116、110等炎性细胞因子的mRNA表达水平在被诱导损伤3小时以及5小时后也均明显增加。四、渥曼青霉素预处理能够减轻脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤过程中肝脏的损伤程度,抑制炎性细胞因子的分泌1.相比于渥曼青霉素未处理组,渥曼青霉素预处理组小鼠的血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的含量明显降低。2.相比于渥曼青霉素未处理组,渥曼青霉素预处理组小鼠肝脏内充血和炎性细胞浸润明显减少,病理学损伤明显改善。3.相比于渥曼青霉素未处理组,渥曼青霉素预处理组小鼠肝脏内凋亡细胞数量明显减少,caspase-3的活化水平明显降低。4.相比于渥曼青霉素未处理组,渥曼青霉素预处理组小鼠肝脏内除Mcp 1之外的Tnfa、I11β、I16、I110等炎性细胞因子的mRNA的水平明显降低。五、渥曼青霉素预处理能够抑制脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤过程中肝组织自噬水平的升高1.相比于渥曼青霉素未处理组,渥曼青霉素预处理组小鼠肝组织中自噬水平的升高明显被抑制,回归未诱导肝损伤之前的本底水平。2.相比于渥曼青霉素未处理组,渥曼青霉素预处理组小鼠肝组织中自噬小体的形成也明显减少。六、预注射渥曼青霉素能够抑制脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤过程中肝组织内MAPK和NF-κB通路的活化1.相比于未预注射渥曼青霉素组,预注射渥曼青霉素组小鼠肝组织内pJNK、p38活化水平没有变化,但pERK活化水平受到抑制。2.相比于未预注射渥曼青霉素组,预注射渥曼青霉素组小鼠肝组织内p65的活化水平受到抑制。结论及意义以上实验结果说明在脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠急性肝损伤过程中,脂多糖/D-半乳糖胺不仅能通过诱导Tnfa等炎性细胞因子的分泌导致肝组织的坏死和凋亡,还能导致自噬水平的升高。然而,渥曼青霉素预处理可抑制自噬,与此同时,渥曼青霉素还能降低炎性细胞因子的水平,减轻肝组织的坏死和凋亡,并最终减轻肝脏的损伤程度。但因为渥漫青霉素并非自噬的特异性抑制剂,我们并不能确定是否是由于渥曼青霉素抑制了自噬从而使得肝组织坏死、凋亡以及肝损伤减轻的。我们的研究结果首次发现了渥曼青霉素能够在体内有效的减轻脂多糖/D-半乳糖胺诱导的小鼠的急性肝损伤,这为临床上研发治疗肠源性内毒素诱导的急性肝损伤的药物提供了重要的借鉴意义；另外我们还发现自噬在该过程中有可能起着重要的作用,这对进一步探究肠源性内毒素诱导的急性肝损伤的发病机理、探寻新的治疗方法均具有重要的理论意义和潜在的应用意义。