过氧化物还原酶Ⅱ(PeroxiredoxinⅡ,PrxⅡ)是典型的2-Cys氧化还原酶类,属于硫氧还蛋白家族(Trx)。能够清除过氧化氢、有机过氧化物及过氧亚硝酸盐等保护细胞免受侵害。在抗氧化过程中,催化活性中心的过氧化半胱氨酸巯基被氧化成二硫化物,二硫化物被谷氧还蛋白(Glutaredoxin,Grx)等含巯基的蛋白特异性还原,再生为有催化活性的还原态,使催化能够循环。根瘤菌是原核的革兰氏阴性菌,在自然界中以在土壤中自由生长和与豆科植物共生两种方式存在。当根瘤菌侵染豆科植物时,会建立共生固氮体系,可以将大气中的氮固定成氨,供给植物利用;同时植物会为根瘤菌提供固氮所需要的能量及营养物质。在固氮过程中,需要保持根瘤中的低氧环境,从而保证遇氧会失活的固氮酶活性,prxⅡ在保持低氧环境中有重要作用。查询NCBI经过生物信息学分析,在豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)3841中发现了三个PrxⅡ基因:RLPrxⅡA(RL1259),RLPrxⅡB(RL2440),RLPrxⅡC(pRL120247)。本研究通过分别构建PrxⅡ单突变体,研究了其在自由生长以及与植物共生中的功能和作用机制。利用分子生物学方法将PrxⅡA、PrxⅡB和PrxⅡC克隆到自杀载体pK19mob和pJQ200SK上,构建出重组载体pJQPrxⅡA?Spec、pKPrxⅡB和pJQPrxⅡC?Tc。进一步通过三亲本杂交方法,将重组质粒导入根瘤菌中。然后通过蔗糖筛选,以及菌落PCR验证,成功构建三个PrxⅡ基因突变株。通过PrxⅡ基因突变株的自由条件下以及与在氧化物胁迫条件下的生长实验,研究了PrxⅡ在根瘤菌生长和氧化应激下的功能。结果表明PrxⅡA、PrxⅡB和PrxⅡC基因的突变对根瘤菌自由生长没有影响。氧化物胁迫实验发现,H2O2处理菌株时,与RL3841相比,RL prxⅡA在20 mmol/L低浓度时敏感,RL prxⅡC在高中低浓度时均敏感,RL prxⅡB则未有明显差异;CuOOH处理菌株时,三个单突变体均在20 mmol/L时抑菌圈直径显著增大,氧化物浓度升高,则没有显著差异。结果表明:PrxⅡ基因突变不影响根瘤菌的自生生长,但在抵御氧化物的胁迫反应中发挥重要作用。通过根瘤菌与甜豌豆的盆栽实验,研究了PrxⅡ基因在共生固氮中的功能。利用乙炔还原法测定突变体与野生型的固氮酶活发现,三个单突变体的固氮酶活均显著降低,但单突变体之间并没有显著差异。统计种植4周植株根瘤数发现,PrxⅡ基因的突变均降低了结瘤数。将种植4周的根瘤进行石蜡切片及电镜切片观察prxⅡC基因的突变类菌体提前进入衰亡期,根部大部分类菌体已呈现解体状态。表明了prxⅡ基因在根瘤菌的抗氧化胁迫及共生固氮中的重要地位。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验,研究PrxⅡ基因在根瘤菌不同条件下的表达量。实验分析发现,prxⅡA基因在根瘤生长中期,表达量显著增高,但是在H2O2胁迫和厌氧条件下其表达没有显著差异;prxⅡB基因在厌氧环境下表达量显著增高,但是在根瘤的不同生长期及H2O2胁迫下,表达并未受到影响;prxⅡC基因在厌氧环境下,根瘤的不同生长期与H2O2胁迫下的表达均没有受影响;表明prxⅡ三个基因在共生过程中的不同表达,使其在固氮中能更好的发挥作用,突出了重要性。