肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是威胁人类健康的重要疾病。在全世界范围内,其发病率已跃居肿瘤发病率第五位,而致死率则居第二位。HCC的发病大致遵循“慢性炎症-肝硬化-肝癌”的规律,是炎症向癌症转化的典型疾病。多种原因导致的肝脏持续性炎症进展过程中,一方面,肝细胞感知微环境中的炎性因素(IL-6、IL-23及高载量的HBV、HCV),介导肝细胞内多种信号通路激活,如转录激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)及核因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)/p65信号途径,促进肝癌细胞生长、转移,抑制肝癌细胞凋亡；另一方面,微环境因素及肝癌细胞通过直接或间接方式“驯化”肝脏浸润淋巴细胞,介导免疫细胞功能耗竭,有利于肝癌细胞逃避免疫反应。因此,阐明肝脏炎-癌转化过程中介导肝细胞-免疫微环境相互作用的关键节点具有重要意义。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-3, Tim-3)是Tim家族成员中一员。2001年,Tim-3作为CD4+Th1细胞表面标志被克隆,并被发现可与其配体Gal-9结合,负向调控Th1型反应。随后的研究发现,除Th1外,Tim-3可表达于多种免疫细胞,如CD8+T细胞、NK细胞、单核-巨噬细胞及NKT细胞等,并通过介导CD8+T细胞和NK细胞功能耗竭、增强Treg细胞免疫抑制功能等多种方式,在慢性病毒性感染及肿瘤发生中发挥重要作用。本实验室前期围绕Tim-3在慢乙肝和肝癌中的作用开展了系列研究,发现Tim-3通过介导CD8+T细胞和NK细胞的功能耗竭,参与HBV感染慢性化进程；肿瘤相关巨噬细胞Tim-3异常高表达,诱导其向M2样表型极化,促进肝癌的生长。以上结果表明,Tim-3通过多种方式、在多个环节调控微环境,参与肝脏慢性炎症及肝癌的发生发展,提示Tim-3在肝脏炎-癌转化中的关键作用,深入研究其作用的细胞和分子网络具有重要意义。近期有文献报道,除免疫细胞外,Tim-3在前列腺癌、宫颈癌、肾透明细胞癌、肺癌等多种肿瘤实质细胞异常表达,并与肿瘤临床指标显著相关,但其表达模式及生物学作用不同。肝癌细胞是否表达Tim-3,其在肝癌细胞中发挥什么功能,迄今尚未见报道。本论文一方面研究Tim-3在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞生物活性的影响；另一方面,收集正常人、慢乙肝患者及HCC患者外周血,检测Tim-3在不同免疫细胞亚群中的表达,初步探讨在肝脏慢性炎症向癌症转化过程中Tim-3的表达规律。第一部分Tim-3在肝癌细胞中的表达及其作用研究本实验室前期临床结果显示,与癌旁组织相比,肝癌实质细胞Tim-3表达显著升高,细胞系研究发现HBV及其编码蛋白促进肝癌细胞中Tim-3转录。在此基础上,本部分进一步研究Tim-3在肝癌细胞中的表达及其生物学功能,并初步探讨Tim-3可能调控的下游信号通路。1.多种细胞因子及HBV促进肝癌细胞Tim-3表达为研究微环境炎性因素对肝癌细胞Tim-3表达的调控作用,将不同细胞因子按浓度梯度刺激肝癌细胞系HepG2及SMMC7721,或将HBV及其编码蛋白的过表达质粒与空载体分别转染HepG2及SMMC7721细胞系,提取细胞总RNA及蛋白,RT-PCR及Western blot检测Tim-3表达。结果显示,IL-4、IL-6.TGF-p.HBV及其编码蛋白均可显著促进肝癌细胞系Tim-3表达。提示肿瘤微环境中的多种因素促进肝癌细胞中Tim-3表达。同时,提取HepG2及SMMC7721细胞总RNA,RT-PCR检测Tim-3分子不同配体的表达,结果显示,肝癌细胞内源性表达Tim-3的配体CEACAM-1. HMGB1及Galectin-9.2.Tim-3通过激活NF-κB、IL-6/STAT3通路,显著促进肝癌细胞生长为进一步研究肝癌细胞表达Tim-3的生物学意义,进行下列实验：2.1 Tim-3过表达促进荷瘤鼠体内肝癌细胞生长将小鼠肝癌细胞H22接种于Balb/c小鼠腹股沟处,待瘤体长至直径为2-3mm左右,瘤内注射Tim-3过表达及空质粒,次/2天,并测量瘤体的长径及短径,至第14天时脱颈处死小鼠,剥离瘤体并拍照、称重。RT-PCR验证Tim-3的过表达情况。结果显示：过表达Tim-3后,瘤体增长的速度明显高于空载体组,提示,Tim-3过表达可明显促进荷瘤鼠体内肝癌细胞的生长。2.2 Tim-3过表达促进肝癌细胞体外增殖将Tim-3过表达质粒及空载体分别转染HepG2及SMMC7721细胞系,CCK-8法检测肝癌细胞增殖,结晶紫染色观察细胞克隆形成能力。结果显示：Tim-3可有效促进上述2种细胞系增殖及克隆形成能力。同时,建立Tim-3稳定表达的HepG2细胞,siRNA干扰Tim-3表达(无关序列NC为对照),CCK-8结果显示Tim-3过表达介导的细胞增殖被逆转。Annexin-V及PI染色结果显示：Tim-3过表达不影响HepG2 及 SMMC7721细胞死亡。流式细胞术检测肝癌细胞的细胞周期,结果显示,过表达Tim-3后,上述两种肝癌细胞系G1期细胞减少,S期细胞增多。同时,Western blot检测显示,与空载体转染组相比,Tim-3过表达细胞PCNA表达明显增强,且Cyclin A及Cyclin D表达升高。进一步表明：Tim-3通过影响细胞周期促进肝癌细胞生长。2.3 Tim-3激活NF-κB、IL-6/STAT3通路Tim-3及空载体转染HepG2及SMMC7721细胞后,收集蛋白,ELISA及RT-PC R检测IL-6表达情况,Western blot检测相关信号通路分子,结果显示：与对照组相比,Tim-3过表达组IL-6表达明显增加,且p-STAT3及p-p65均明显升高,提示Tim-3激活肝癌细胞内STAT3及NF-κB通路。功能实验结果显示,NF-κB、STAT3抑制剂均可逆转Tim-3过表达对HepG2细胞的促增殖作用,而Tim-3中和抗体(大鼠IgG做对照)则阻断了IL-6的促增殖作用。提示Tim-3通过NF-κB、IL-6/STAT3通路促进肝癌细胞增殖。3. Tim-3过表达促进T细胞耗竭肝癌细胞不仅具有恶性增殖能力,而且通过多种机制介导T细胞免疫耗竭,逃逸机体抗肿瘤免疫。为探讨肝癌细胞异位表达Tim-3对抗肿瘤免疫的影响,设计进行如下实验：3.1 Tim-3过表达HepG2细胞抑制Jurkat T细胞增殖将稳定转染Tim-3及空载体的HepG2与Jurkat T细胞共培养,CFSE染色结果显示,过表达Tim-3的HepG2细胞可明显抑制Jurkat T细胞的增殖；并且增加Annexin-V+ Jurkat T细胞的比例。提示,表达于HepG2中的Tim-3可通过抑制Jurkat T细胞的增殖及促进其凋亡来抑制T细胞功能。3.2 Tim-3过表达HepG2细胞显著抑制CD4+T、CD8+T细胞功能分离健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC),磁珠分选CD4+T、CD8+T细胞,将其与稳定转染Tim-3或空载体的HepG2细胞共培养,CFSE染色检测T细胞增殖,离子霉素+PMA刺激后检测T细胞IFN-y表达,Annexin-V染色检测T细胞凋亡。流式分析结果显示：与空载体组相比,过表达Tim-3的HepG2细胞能抑制CD4+T、CD8+T细胞增殖及分泌IFN-γ的能力,并增加Annexin-V+细胞的数目。综上,肿瘤微环境中存在的多种细胞因子及病原体(HBV)促进Tim-3在肝癌细胞中的异位表达,进而激活NF-κB、IL-6/STAT3通路,显著促进肝癌细胞生长；同时,Tim-3异位表达的肝癌细胞抑制T细胞增殖与细胞因子产生,介导免疫耗竭,促进肝癌的发生、发展。第二部分Tim-3在不同肝病患者外周血单个核细胞中的表达及其临床意义Tim-3可表达于多种适应性免疫及固有免疫细胞,负向调节免疫应答。已有研究表明,Tim-3在慢性感染及肿瘤中通过抑制T细胞及NK细胞功能,参与慢性感染及肿瘤进展。本研究系统检测了正常人、慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B, CHB)及肝癌患者外周血不同免疫细胞表面Tim-3的表达,以期为Tim-3作为炎-癌转化关键节点提供更为直接的临床数据。1.CHB及HCC患者外周血T细胞及NK细胞Tim-3表达明显升高,且与肝癌患者HBV感染、肝功指标及肿瘤分级相关收集24例慢乙肝患者,34例肝癌患者及22例健康人外周血,分离PBMC。流式细胞术检测CD4+T、CD8+T及NK细胞中Tim-3表达。结果显示：CHB及HCC患者CD4+T、CD8+T及NK细胞中Tim-3+细胞的百分比均明显高于健康人,且Tim-3的表达由慢乙肝向肝癌逐渐升高。统计学分析发现,HBsAg日性的肝癌患者外周血CD4+T, CD8+T及NK细胞表面Tim-3表达明显高于HBsAg阴性患者。同时,与I-II级HCC患者相比,Ⅲ-Ⅳ级HCC患者Tim-3表达较高。且CD4+、CD8+T细胞表面Tim-3的表达水平与患者血清ALI、AST水平呈正相关,而NK细胞表面的表达水平与患者血清AFP水平呈正相关。以上结果提示,Tim-3有可能参与HBV相关慢性肝炎向肝癌的转化。2.Tim-3与免疫抑制分子P D-1、NKG2A共表达收集20例HCC患者外周血,流式检测CD8+T细胞PD-1与Tim-3表达,结果显示：CD8+T细胞表面PD-1与Tim-3表达呈明显正相关。同时,流式表型分析发现,与NKG2A-群细胞相比,NKG2A+N K细胞表达更多的Tim-3,但Tim-3在NKG2D阳性群与阴性群之间没有明显表达差异。3.HCC患者外周血Tim-3+T细胞及NK细胞表现为功能抑制的表型3.1 HCC患者外周血Tim-3+CD4+T、CD8+T细胞增殖能力减弱收集并分离10例HCC患者PBMC, α-CD3、α-CD28刺激并培养4天后,流式细胞术比较Tim-3阳性与阴性CD4+、CD8+T细胞增殖。结果发现,Tim-3阳性CD4+、CD8+T细胞群的增殖明显弱于Tim-3阴性群。3.2 HCC患者外周血Tim-3+CD4+T、CD8+T及NK细胞IFN-γ分泌明显降低收集并分离10例HCC患者PBMC,离子霉素+PMA刺激6h,流式细胞术检测(?)CD4+T、CD8+T及NK细胞IFN-γ表达。结果显示,Tim-3阳性CD4+T、CD8+T及NK细胞IFN-γ表达明显低于Tim-3阴性群。CD107α染色显示,Tim-3降低CD107α+NK细胞的比例。以上结果再次显示,Tim-3表达升高与HCC患者CD4+T、CD8+T及NK细胞的功能抑制相关。4.HCC术后患者外周血T细胞群Tim-3显著降低收集并分离10例HCC患者术前及术后PBMC, RT-PCR检测Tim-3表达,发现：术后7-14天,患者外周血PBMC中Tim-3表达明显降低。同时,流式细胞术检测CD4+T、CD8+T及NK细胞表面Tim-3表达,结果显示：术后7-14天,CD4+T、CD8+T细胞表面Tim-3表达显著降低,但NK细胞表面Tim-3表达无明显变化。综上所述,CHB、 HCC患者外周血CD4+T、CD8+T及NK细胞表面Tim-3显著升高,且Tim-3由CHB向HCC逐渐升高；肝癌患者Tim-3表达与肝癌分期显著相关,而手术后患者外周免疫细胞Tim-3表达明显降低。提示,Tim-3参与CHB向HCC转化。