研究背景：急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是一类以原始T淋巴细胞的增殖异常、分化障碍、凋亡受阻为特点的恶性克隆性疾病。Notch信号通路是细胞增殖与分化调控中的重要信号转导系统,其异常表达可造成造血系统恶性增殖性疾病。研究显示超过一半的T-ALL患者存在Notchl信号的异常激活。乏氧是肿瘤发生发展的关键因素,也是肿瘤易产生耐药、疗效差的重要原因。研究证实,骨髓中存在乏氧环境,且大量增殖的白血病细胞及继发性贫血可能使骨髓处于更加低氧的状态。乏氧环境下肿瘤细胞可发生一系列基因表达的改变,其中乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factors-1, HIF-1)是机体内乏氧反应的重要转录调控因子。HIF-1转录复合体是由α亚单位(HIF-1α)和p亚单位(HIF-1β)组成的异源二聚体。HIF-1α是受乏氧调节的亚基,在乏氧环境下迅速积聚,并激活下游基因表达,参与红细胞生成、血管形成和能量代谢的调节等生理过程。近年来在多种实体瘤中均发现乏氧环境下Notch信号通路的激活,提示HIF-1可能通过Notch通路促进肿瘤细胞的生长、侵袭和耐药。第一部分乏氧环境下HIF-1α与Notchl通路活性的变化及其机制研究目的：研究HIF-1α与Notch1基因在乏氧环境下的表达水平；探讨HIF-1α与Notch1可能存在的内在联系；阐明乏氧环境下T-ALL细胞中HIF-1和Notch1的相互作用及作用机制。研究方法：1. T-ALL细胞的乏氧培养：将T-ALL细胞系Jurkat和Sup-T1置于乏氧环境下(2%O2,93%N2and5%CO2)培养,48h后应用Real time RT-PCR和Western blot检测HIF-1α、Notch1mRNA和蛋白的表达变化。2. Real time RT-PCR方法检测乏氧对HIF-1α和Notch1通路mRNA表达水平的影响：TRIzol方法提取细胞总RNA,使用M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,应用Real time RT-PCR检测HIF-1α、VEGF、Notchl和Hes1基因mRNA水平的表达情况。3. Western blot方法检测乏氧对HIF-1α、Notchl通路蛋白表达水平的影响：应用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白,10%SDS-PAGE胶进行凝胶电泳,Western blot方法检测HIF-1α、Notchl ICN和Hes1蛋白水平的表达情况。4. RBP-Jk报告质粒检测乏氧环境对Notch信号水平的影响：将Jurkat细胞应用Lipofectamine LTX and PlusTM共转染RBP-Jk报告质粒和内参质粒。乏氧环境下培养48h后裂解细胞并收集裂解液,应用Promega双荧光素酶检测试剂盒检测信号强度。5. siRNA片段的转染：应用Lipofectamine2000分别将针对HIF-1α、Notch1的siRNA片段转染T-ALL细胞Sup-T1和Jurkat。72h后应用Real time RT-PCR和Western blot检测siRNA片段对HIF-1α、Notch1mRNA和蛋白表达的阻断效率。6. Real time RT-PCR检测乏氧环境下阻断HIF-1α/Notch对其信号通路基因表达的影响：实验细胞分为4组：正常对照组、阴性对照组、HIF-la siRNA转染组和Notchl siRNA转染组。将T-ALL细胞转染siRNA片段后置于乏氧环境培养48h,Trizol方法提取组织总RNA,在一定的反应体系中逆转录成cDNA, Real time RT-PCR方法检测HIF-1α、Notch1, Hes1基因mRNA水平的表达情况。7. Western blot检测乏氧环境下阻断HIF-1α/Notch对其信号通路蛋白表达的影响：将T-ALL细胞转染siRNA片段后置于乏氧环境培养48h,提取细胞总蛋白,Western-blot检测HIF-1α、Notchl ICN和Hes1蛋白的表达情况。研究结果：1.乏氧下HIF-1α表达升高,激活Notchl信号通路：T-ALL细胞在乏氧环境下培养48h后与常氧比较,Real time RT-PCR显示,HIF-1α的mRNA表达水平无明显变化,但其下游基因VEGF表达升高；同时Notch1、Hes1基因表达水平显著上调。Western blot显示,HIF-1α蛋白呈高表达,且Notchl ICN、 Hes1蛋白表达水平上调。双荧光素酶报告基因实验显示,乏氧环境能够在转录水平正调控Notch1信号通路活性。2.针对HIF-1α或Notch1的siRNA片段可以有效下调HIF-1α或Notch1表达：siRNA转染后72h, Real time RT-PCR及Western blot结果显示所用siRNA片段可有效下调HIF-1α或Notch1的表达水平。3.乏氧诱导下Notch1通路的激活依赖于HIF-1α:利用HIF-1α siRNA下调HIF-1α表达后将T-ALL细胞置于乏氧下培养48h, Real time RT-PCR及Western blot显示HIF-1α. Notch1、Hes1表达水平均较阴性对照组降低。利用Notch1siRNA下调Notch1表达后将T-ALL细胞置于乏氧下培养48h,Real time RT-PCR及Western blot显示HIF-1α表达与阴性对照组比较无明显变化,Notch1、Hes1表达水平均降低。结论：1.乏氧环境下T-ALL细胞中HIF-1α蛋白表达增加。2.乏氧环境对T-ALL细胞中HIF-1α表达的调控发生在蛋白水平。3.乏氧环境能够在转录水平正调控T-ALL细胞中Notch1信号通路活性。4.乏氧环境对T-ALL细胞中Notchl信号通路的正调控作用依赖于乏氧下HIF-1α的激活。第二部分乏氧环境对T-ALL细胞生物学行为及耐药性的影响及其机制研究目的：研究T-ALL细胞在乏氧环境下生物学行为及耐药性的改变；探讨HIF-1α和Notch1信号通路在其中的作用,并阐明其作用机制,为该病的靶向治疗提供理论依据和实验室基础。研究方法：1.乏氧对T-ALL细胞增殖的影响及其作用机制。1.1CCK8实验检测乏氧对T-ALL细胞增殖的影响：将T-ALL细胞系Jurkat和SupT1分别置于常氧及乏氧环境下培养24h、48h、72h, CCK8实验检测乏氧对细胞增殖的影响。1.2流式细胞术检测乏氧对细胞周期的影响：将T-ALL细胞系分别置于常氧及乏氧环境下培养48h,收集细胞,PI染色后利用流式细胞仪检测细胞的周期变化。1.3Western blot检测乏氧对细胞周期蛋白表达的影响：将T-ALL细胞系分别置于常氧及乏氧环境下培养48h,提取细胞总蛋白,检测乏氧对细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK2、P21表达水平的影响。1.4阻断HIF-1α或Notch1表达对细胞增殖及周期的影响：利用HIF-1α或Notch1siRNA分别下调HIF-1α或Notch1表达,将T-ALL细胞系置于乏氧环境下培养,CCK8实验检测细胞增殖情况；流式细胞术检测细胞周期改变；Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK2、P21表达水平。2.乏氧对T-ALL细胞侵袭能力的影响及其作用机制。2.1Transwell实验检测乏氧对T-ALL细胞侵袭能力的影响：将细胞置于包被好Matrigel的Transwell小室,分别于常氧及乏氧环境下培养48h后计数穿膜细胞数。2.2Real time RT-PCR实验检测乏氧对侵袭相关蛋白MMP2、MMP9mRNA表达水平的影响：将T-ALL细胞系分别于常氧及乏氧环境培养48h,Trizol方法提取组织总RNA,检测乏氧对侵袭相关蛋白MMP2和MMP9mRNA表达水平的影响。2.3Western blot实验检测乏氧对侵袭相关蛋白表达水平的影响：将T-ALL细胞系分别置于常氧及乏氧环境下培养48h,提取细胞总蛋白,检测乏氧对侵袭相关蛋白MMP2和MMP9表达水平的影响。2.4阻断HIF-1α或Notchl表达对细胞增殖及周期的影响：利用HIF-1α或Notchl siRNA分别下调HIF-1α或Notchl表达,将T-ALL细胞系置于乏氧环境下培养,Transwell实验检测细胞侵袭能力的改变；Real time RT-PCR及Western blot检测MMP2和MMP9表达水平。3.乏氧对T-ALL细胞耐药性的影响及其作用机制。3.1T-ALL在乏氧环境下培养24h后,加入1μMM地塞米松后置于乏氧环境培养48h。应用流式细胞术和Western blot检测乏氧对细胞凋亡的影响。3.2流式细胞术检测乏氧对细胞耐药性的影响：AnnexinV/PI双染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。3.3Western blot检测乏氧对细胞耐药性的影响：提取细胞总蛋白,检测凋亡相关蛋白的表达水平。3.4阻断HIF-la或Notchl表达对细胞耐药性的影响：利用HIF-1α或Notch1siRNA分别下调HIF-1α或Notchl表达,加入1μM地塞米松在乏氧环境下孵育48h收集细胞。流式细胞术检测细胞凋亡率；Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。研究结果：1.乏氧环境对T-ALL细胞具有明显的促增殖作用。其促增殖作用与乏氧下Notch1信号通路的激活相关。1.1乏氧促进T-ALL细胞增殖：CCK8实验显示,Jurkat和Sup-T1细胞在乏氧环境下的增殖速率显著高于常氧环境。1.2乏氧环境下T-ALL细胞G0/G1期细胞比例降低：流式细胞术检测细胞周期结果显示,Jurkat和Sup-T1细胞在乏氧环境下培养48h后,G0/G1期细胞比例较常氧降低,同时S期和G2/M期细胞比例升高。1.3乏氧环境下细胞周期蛋白p21表达水平降低,Cyclin D1和CDK2表达升高：Western blot结果显示,乏氧环境可下调p21表达水平,上调Cyclin D1和CDK2表达,从而降低T-ALL细胞G0/G1期细胞比例。1.4阻断HIF-1α表达可显著降低乏氧环境下T-ALL细胞增殖速率：利用HIF-1αsiRNA下调HIF-1α表达后将细胞置于乏氧环境下培养,CCK8结果显示,干扰组的增殖速率显著低于阴性对照组。流式细胞术检测细胞周期结果显示,干扰组G0/G1期细胞比例显著高于阴性对照组。利用Western blot检测细胞周期蛋白表达发现,阻断HIF-1α可升高T-ALL细胞乏氧环境下p21表达水平,降低Cyclin D1和CDK2表达水平。1.5阻断Notchl表达可抑制乏氧对T-ALL细胞的促增殖作用：利用Notchl siRNA阻断Notchl表达后将细胞置于乏氧环境下培养。CCK8结果显示,干扰组的增殖速率显著低于阴性对照组。流式细胞术检测细胞周期结果显示,干扰组G0/G1期细胞比例显著高于阴性对照组。利用Western blot检测细胞周期蛋白表达显示,下调Notchl表达水平后T-ALL细胞在乏氧环境下p21蛋白表达较阴性对照组升高,Cyclin D1和CDK2蛋白表达水平降低。2.乏氧环境下T-ALL细胞侵袭能力增强。其作用机制与HIF-1α激活Notch1信号通路相关。2.1乏氧环境下T-ALL细胞侵袭能力增强：Transwell结果显示,乏氧环境下穿膜细胞数较常氧明显升高。2.2乏氧环境下T-ALL细胞的MMP2和MMP9表达升高：Real-time RT-PCR和Western blot结果显示,乏氧培养可上调T-ALL细胞中侵袭相关蛋白MMP2和MMP9表达水平,从而引起侵袭能力的变化。2.3阻断HIF-1α表达可显著减弱乏氧环境下T-ALL细胞的侵袭能力：利用HIF-1αsiRNA阻断HIF-la表达后将细胞置于乏氧环境下培养48h,Transwell结果显示HIF-1α干扰组侵袭能力降低。Real-time RT-PCR和Western blot结果表明阻断HIF-1α表达可显著降低乏氧环境下MMP2和MMP9表达水平。2.4下调Notchl表达可抑制乏氧对T-ALL细胞的促侵袭作用：利用Notchl siRNA阻断Notch1表达后将细胞置于乏氧环境下培养48h,Transwell结果显示干扰组侵袭能力较阴性对照组显著降低。Real-time RT-PCR和Western blot结果显示干扰组在乏氧环境下MMP2和MMP9表达降低。3.乏氧环境下T-ALL细胞对化疗药物地塞米松的耐药性增强。其作用机制与HIF-1α激活Notch1信号通路相关。3.1乏氧环境下T-ALL细胞对化疗药物地塞米松的耐药性增强：利用流式细胞术检测细胞凋亡率显示,乏氧下地塞米松诱导细胞凋亡率低于常氧。3.2乏氧环境可上调抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达：Western blot结果显示,乏氧环境下T-ALL细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL表达升高,从而降低caspase9、caspase3的活性,使地塞米松诱导细胞凋亡率下降。3.3下调HIF-1α后T-ALL细胞在乏氧环境下的化疗药物敏感性增强：利用HIF-1αsiRNA阻断HIF-1α表达后,加入1μM地塞米松在乏氧环境下培养48h。流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,下调HIF-1α后地塞米松在乏氧环境下的诱导凋亡率显著升高。Western blot结果表明HIF-1α干扰组Bcl-2. Bcl-xL表达较阴性对照组下调,caspase9、caspase3及PARP的活性片段表达上调。3.4阻断Notch1表达后T-ALL细胞在乏氧环境下的耐药性降低：利用Notch1siRNA阻断Notch1表达,加入1μM地塞米松在乏氧环境下培养48h,利用流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,Notch1干扰组细胞凋亡率显著高于阴性对照组。Western blot结果显示下调Notch1表达可降低Bcl-2、 Bcl-xL表达水平,使caspase9、caspase3及PARP的活性提高。结论：1.乏氧与HIF-1α可促进T-ALL细胞增殖,增强细胞侵袭能力,增加细胞耐药性。其功能的发挥依赖于HIF-1α作用下Notch1信号通路的激活。2. HIF-1α和Notch1有望成为治疗T-ALL的新靶点,为T-ALL的治疗提供新策略。