1背景及目的南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B,CALB)是目前应用最广泛的、最具潜力的商业脂肪酶之一。它对于非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活力,并且具有良好的稳定性,在转酯等反应中显示出优于其他脂肪酶的性质。目前,CALB游离脂肪酶已在大肠杆菌、酵母等系统中获得表达,但是分离纯化困难、固定化酶生产成本高一直都是制约CALB工业化应用的瓶颈。本研究的目的是采用微生物固定化脂肪酶方法,利用酿酒酵母作为微生物固定化载体,将CALB展示在酵母细胞表面,成为全细胞催化剂,并进行低成本工业化培养基发酵培养。2方法及结果根据CALB的成熟多肽序列,人工优化并合成calb基因(仅成熟肽),将其克隆到质粒pYD1中的AGA2基因下游,重组质粒转化S. cerevisiae EBY100菌株,构建表面展示CALB的酵母工程菌株;通过传代培养筛选遗传学稳定性良好的重组菌株。选用工业化培养基进行重组菌的发酵优化实验。最终确定发酵条件为:pH5.0,接种量10%,溶解氧大于30%,在重组酿酒酵母生长阶段,发酵温度控制在28℃,并采用葡萄糖浓度反馈方式进行补料,经过22h的培养后,细胞光密度OD600可达到36.5,开始补加半乳糖诱导CALB的表达;在目的蛋白表达阶段,发酵温度则控制在25℃,半乳糖浓度2%。经过在2.5L发酵罐中经过82h发酵,细胞OD600可达到53.3,目的蛋白CALB的酶活力达到4.25U/ml。3意义以酿酒酵母表面展示系统固定化南极假丝酵母脂肪酶,生产工艺简单,不必分离纯化蛋白,大大降低酶生产成本,并且酿酒酵母已广泛应用于医药、食品行业,具有良好的生物安全性和环境保护作用。