背景:鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis) (以下简称鼠疫菌)引起的烈性传染病,同时也是一种标准的生物战剂和生物恐怖剂。鼠疫菌的主要保护性抗原是F1(荚膜抗原)和LcrV(V-抗原),以保护性抗原作为亚单位疫苗成为当今鼠疫疫苗的重要研究方向。F1抗原由鼠疫菌pMT1质粒上的F1操纵子编码,以多聚体的形式在细胞表面形成荚膜,F1抗体通过阻断F1蛋白的抗吞噬作用从而具有免疫保护作用。由pCD1质粒编码的V抗原(LcrV)是鼠疫菌重要的毒力因子、低钙反应调节因子和保护性抗原,但存在一定的免疫抑制作用:V抗原在体内除抑制前炎性细胞因子(γ-干扰素、肿瘤坏死因子)的释放外还增加白细胞介素-10的释放,从而抑制宿主的天然免疫应答。最近在V抗原的研究中发现产生免疫抑制作用的区段为271-300氨基酸,从全长V抗原(326个氨基酸)中去除这个区段可有效地降低V抗原的免疫抑制作用而同时保留其免疫保护作用。近来我们发现在云南感染东方型鼠疫菌的病人血清中检测不到V抗原的抗体,这也决定了采用F1和V抗原联合应用成为鼠疫疫苗的亚单位疫苗的热点和方向。方法:采用玻璃珠处理、饱和硫酸铵沉淀和分子筛过滤相结合的方案,从鼠疫菌减毒活疫苗株(EV76)的培养物中提取天然表达的F1抗原。依据已知的LcrV抗原核苷酸序列,避开LcrV抗原产生免疫抑制作用的区段设计引物,克隆表达rV270抗原。表达产物先后经过Co2+亲和层析和Sephacryl S-200 HR凝胶柱纯化,并在纯化过程中应用凝血酶切除His标签。纯化的蛋白用免疫印记法、N-末端测序、质谱肽图、高效液相色谱(HPLC)及紫外光谱扫描方法鉴定其性质和纯度。使用氢氧化铝佐剂分别吸附两种抗原后免疫BALB/c小鼠,使用一次免疫和两次免疫观察两种抗原的单一及联合免疫保护作用,从而得出抗原配伍最佳剂量和联合抗原免疫方法对比结果。结果:本试验建立了一种新型天然鼠疫菌F1抗原的提取与纯化方法,成功提取出纯度超过98%的天然F1抗原。纯化的蛋白通过免疫印记法、N-末端测序、质谱肽图、高效液相色谱(HPLC)及紫外光谱扫描方法鉴定,证明该蛋白正是鼠疫菌F1抗原。通过ELISA检测发现纯化出的天然F1抗原对F1抗体检测的敏感度高于重组rF1抗原。rV270基因成功地克隆到pET24a载体中,并以可溶性方式表达。应用Co2+亲和层析柱和Sephacryl S-200 HR凝胶柱结合凝血蛋白酶切除His标签的方法可得到不含标签的较高纯度目的蛋白。动物实验证实纯化的天然F1抗原和重组的rV270抗原单抗原及联合抗原免疫均产生较高的抗体滴度和均有良好的免疫保护作用,且得到免疫方案和抗原免疫优化剂量组,为下一步亚单位疫苗研制奠定基础。结论:1.本实验所提供的鼠疫菌天然F1抗原的提取、纯化方法,是先从鼠疫菌培养物中分离培养上清和菌体沉淀,再利用饱和硫酸铵沉淀从培养上清中以及利用玻璃珠从菌体沉淀中分别提取出各部分天然F1抗原粗蛋白,再将各部分天然F1抗原粗蛋白各自通过饱和硫酸铵沉淀、凝胶过滤得到各部分纯化的鼠疫菌天然F1抗原,保持了蛋白的天然构象,并且避免了有机溶剂对蛋白活性的影响和对环境的污染。2.为了制备不带任何载体序列的rV270抗原,采用融合表达带His标签的蛋白,然后凝血酶切除标签的策略,使目的蛋白不含有任何载体序列,保持天然的蛋白构象和生物学活性。本研究利用金属螯合亲和层析柱将带有His标签的目的蛋白与其它大量杂蛋白分离,同时利用凝血酶在亲和层析柱上完成标签的切割,然后再利用分子筛进一步对蛋白进行纯化得到了高纯和度的目的蛋白,为下一步动物免疫观察抗原的免疫保护效果提供基础。3.动物实验实验采用不同剂量组的抗原免疫,旨在寻找最佳剂量配伍来免疫动物从而刺激机体产生更高的抗体滴度,增强免疫保护作用和延长免疫时间;使用单抗原和联合抗原免疫,目的是比较单抗原和联合抗原免疫效果,结果证实联合抗原免疫较单抗原免疫能产生更高的抗体滴度;使用一次免疫方案和初次免疫后加强免疫的两次免疫方案对比,得出两次免疫较一次免疫能产生更高的抗体滴度且产生抗体滴度时间更长。从这三方面结论得到免疫方案及抗原免疫优化剂量组,为下一步亚单位疫苗的研制奠定基础。