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作为一种分布广泛的翻译后修饰,蛋白质磷酸化在细胞增殖、代谢、分化和转录等多种生命过程中起着重要的调节作用。目前,检测磷酸化蛋白/肽的重要手段之一即为质谱技术。然而,应用质谱技术直接检测磷酸化肽基本不具有可行性,这是由于磷酸根具有弱电离性以及磷酸化肽在生物样品中存在的丰度十分低。因此,发展有效的分离富集方法以排除干扰、提高质谱检测的灵敏度是必不可少的。近年来,开发高效的亲和材料用来选择性捕获磷酸化肽的研究受到研究者们的高度重视。亲和材料的选择性和高效率取决于其表面的结构特征以及富集磷酸化肽的机理。目前,许多介孔、杂化或化学修饰的亲和材料被制备并用于磷酸化肽的分离富集,包括聚合物材料、介孔材料、整体材料和磁性纳米材料等。磁性纳米材料在很多领域中都有着普遍的应用,如生物医学领域、传感与催化领域,以及分离富集领域等。与传统的吸附剂相比,磁性纳米材料具有良好的磁响应性,可以在外界磁铁的帮助下实现与溶液的迅速分离。磁性纳米粒子本身不具备特异性吸附能力,并且在分离富集过程中容易发生团聚现象。因此,在实际的实验操作时常常会对磁性纳米粒子的表面进行功能化修饰。本论文将对磁性纳米粒子进行各种功能化修饰以提高其特异性吸附能力及稳定性,制备出集高选择性、良好生物相容性、快速磁响应性等于一体的吸附材料,通过与MALDI-TOF MS仪器联用,用于复杂生物样品中低丰度的磷酸化肽的分离与检测。具体的实验内容分为以下五个部分:1.设计了一种以氧化铟修饰的磁性纳米粒子为吸附剂的微流控芯片固相萃取系统,结合MALDI-TOF MS,实现了选择性地富集与检测磷酸化肽。氧化铟修饰的磁性纳米粒子不仅拥有一层氧化铟的外壳,使其具有捕获磷酸化肽的能力,而且由于具有快速的磁响应性,很大程度上加速了样品预处理过程。该方法对标准蛋白质酶解液、脱脂牛奶酶解液和人血清中的磷酸化肽具有较高的选择性。此外,该方法具有检测限低、可重复利用性好等特点,在复杂样品中磷酸化肽的分析领域具有很大的潜力。2.制备了一种TiO2-酰肼功能化的聚酰胺胺树枝状分子（PAMAM）修饰的磁性纳米材料并用于特异性的富集复杂样品中的低丰度磷酸化肽。首先通过将PAMAM连接在硅烷化处理的磁性纳米微球上,随后,将连接到磁球上的PAMAM末端进行酰肼化处理。最后,将TiO2微球嵌入到PAMAM的枝杈部位得到最终的吸附材料。将所制备的磁性复合材料用于分离纯化磷酸化肽,其富集机理为:PAMAM末端酰肼基团与磷酸化肽之间的静电及氢键作用、TiO2与磷酸化肽之间的亲和作用。将该吸附材料结合MALDI-TOF MS检测,获得了低至0.4 fmol的检出限,证明了该方法具备高灵敏度地检测实际样品中磷酸化肽的能力。3.首先制备了一种半胱胺改性的壳聚糖。随后,采用层层自组装技术将多金属氧酸盐和半胱胺改性的壳聚糖修饰到氨基硅烷化的磁性纳米微球上。最后将所制备的复合吸附材料与MALDI-TOF MS联用应用于复杂样品中的磷酸化肽的检测。考察了该材料制备过程中层数的变化对形貌、Zeta电位值、最大饱和磁化强度值及对小磷酸分子吸附效果的影响,得到了最佳的组装层数。在最优的富集和解吸条件下,该方法达到了低至0.02 fmol的检出限,测得回收率为92.6%。4.设计了一种基于钆的固定化金属离子色谱材料用于选择性富集磷酸化肽。采用简便、有效的合成路线,将钆离子固定在谷胱甘肽包覆的磁性纳米粒子表面。该吸附剂结合了Fe3O4的超顺磁性、谷胱甘肽的良好生物相容性、钆离子与磷酸化肽之间强的亲和能力等优点。实验考察了吸附、解吸步骤中的一系列条件。在最优的实验条件下,考察了所制备的材料在一系列复杂样品中高效捕获磷酸化肽的能力。随后,考察了方法的灵敏度、稳定性和重现性,测得的标准偏差分别为0.340（日内）和0.367（日间）。5.制备了剥离的Cu/Ga层状双氢氧化物纳米片,随后将Fe3O4纳米粒子均匀地沉积在其表面上以维持二维形貌。结合MALDI-TOF MS检测手段,将该材料应用于生物样品中低丰度的磷酸化肽的富集检测。由于该材料拥有金属离子含量高、正电荷丰富、比表面积大、生物相容性好和超顺磁性等优点,成功地捕获了脱脂牛奶、唾液、血清等实际样品中的磷酸化肽。此外,应用同位素标记法,该材料在定量检测白血病患者血清中异常调节的磷酸化肽方面也具有良好的性能。本实验为二维材料在生物大分子分离领域的应用开拓了崭新的思路。