肝纤维化(Liver fibrosis)是多种肝脏疾病共同的病理过程,其中一部分会进展为肝硬化和/或肝癌,死亡率高,预后差,严重威胁人类健康。肝纤维化是一种可逆性的损伤-修复过程,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积是促进肝纤维化进展的重要因素,而细胞外基质主要来源于肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs),因此抑制HSCs的活化是逆转肝纤维化的关键。线粒体是生产能量的主要场所,参与多种细胞生命活动,因此,线粒体稳态对维持正常的细胞功能至关重要。线粒体自噬(mitophagy)由Lemasters于2005年首次提出,主要指通过自噬的方式降解细胞内损伤或多余的线粒体,维持线粒体数量及质量的稳定,从而维持正常的细胞功能。研究显示,白藜芦醇可诱导HSCs发生线粒体自噬,表明HSCs中存在线粒体自噬现象。但线粒体自噬与肝纤维化之间的关系,目前尚无报道。本研究拟以C57BL/6雄性小鼠及人HSCs细胞株LX-2为研究对象,建立肝纤维化模型,从动物及细胞层面进行研究,探讨线粒体自噬在肝纤维化中的作用。目的:探讨线粒体自噬在肝纤维化中的作用,为肝纤维化的治疗提供新思路。方法:本实验通过腹腔注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型并用TGF-β刺激LX-2细胞活化,分别在体内及体外观察肝纤维化形成及HSCs活化过程中线粒体自噬的变化。应用线粒体自噬抑制剂Cyclosporine A及诱导剂Valinomycin验证线粒体自噬与肝纤维化及HSCs活化之间的关系。通过检测血清中谷氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase,AST)的水平及肝脏组织HE染色来观察肝脏炎症程度;通过天狼星红染色观察胶原变化,通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)分析α-SMA的表达。用蛋白免疫印迹法(Westen blotting,WB)分析α-SMA、Collagen I、HSP60、TOM20、PINK1蛋白的表达。结果:1肝纤维化及HSCs活化过程中线粒体自噬受到抑制腹腔注射橄榄油(oil)后6 W及注射CCl4后2 W、4 W和6 W,分别留取小鼠血清及肝脏组织,并进行HE、天狼猩红及IHC染色。结果显示与oil组相比,CCl4组血清ALT及AST水平随时间延长逐渐升高;HE染色显示CCl4组肝小叶结构紊乱,炎细胞浸润,肝细胞脂肪变性及坏死严重,6 W时达到高峰;天狼星红染色及WB显示CCl4组胶原纤维随注射时间延长而增加,6 W时达到高峰;IHC及WB显示CCl4组α-SMA表达随用药时间延长增加;上述结果证实肝纤维化造模成功。WB显示在CCl4组中,代表线粒体剩余量的TOM20及HSP60表达显著增加,表明肝纤维化过程中线粒体自噬被抑制。在细胞实验中应用不同浓度梯度及时间梯度的TGF-β刺激HSCs活化,WB结果显示HSCs活化指标α-SMA及Collagen I表达增加,线粒体剩余量指标TOM20、HSP60表达增加,线粒体自噬相关蛋白PINK1表达减少,并且各指标变化呈浓度依赖性及时间依赖性,表明HSCs活化过程中,线粒体自噬减弱。2抑制线粒体自噬促进肝纤维化及HSCs活化动物实验中,与单独应用CCl4组相比,应用线粒体自噬抑制剂CsA后,小鼠肝脏TOM20及HSP60的表达增加,证明CsA能够抑制线粒体自噬。应用CsA后,与单独应用CCl4组相比,小鼠血清ALT、AST水平更高,肝小叶结构紊乱程度、炎细胞浸润、肝细胞脂肪变及坏死程度更重,胶原沉积更加明显、α-SMA表达进一步上调,表明线粒体自噬抑制剂CsA可促进肝纤维化进程。细胞实验中,与单纯TGF-β刺激组比较,应用线粒体自噬抑制剂后,线粒体剩余量标志TOM20、HSP60表达增加,线粒体自噬相关蛋白PINK1表达减少,肝纤维化指标α-SMA及Collagen I表达增加,表明抑制线粒体自噬可促进HSCs的活化。3线粒体自噬诱导剂抑制HSCs活化WB结果显示,与单纯TGF-β组比较,应用线粒体自噬诱导剂后,线粒体剩余量标志TOM20、HSP60减少,线粒体自噬相关蛋白PINK1表达增加,HSCs活化指标α-SMA及Collagen I表达减少,结果提示诱导线粒体自噬能够抑制HSCs活化。结论:在肝纤维化形成及HSCs活化中线粒体自噬受到抑制。抑制线粒体自噬能促进HSCs活化,加重肝纤维化,而诱导线粒体自噬可抑制HSCs活化。干预线粒体自噬有望成为肝纤维化治疗的新靶点。