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背景:胰腺癌是恶性程度最高的消化系统肿瘤之一。在西方发达国家,其是男性恶性肿瘤第五大死亡原因,女性恶性肿瘤第四大死亡原因。在我国,胰腺癌居恶性肿瘤发病率第七位,死亡率第六位。胰腺癌起病隐匿,难以早期诊断,患者确诊时,约有50%已出现全身转移;且存在手术切除率低,病理类型恶性度高,对放化疗的敏感性差等因素,其五年生存率仅有4%,中位生存时间仅4-5个月。因此,尽早阐明胰腺癌发生发展的细胞分子生物学机制,对于提高胰腺癌的早期诊断及治疗效果,有着重要的临床应用价值。肿瘤新生血管生成与肿瘤的生长和转移密切相关。有研究表明,当原发肿瘤体积达到2mm3时,其能否继续生长极度依赖于新生血管形成的能力。然而,在血管形成供给原位肿瘤营养的同时,也将从原发灶脱落的肿瘤细胞带入到循环系统,从而促进了肿瘤的转移。研究发现多种信号分子、受体及信号通路参与了肿瘤新生血管形成及侵袭转移,其中VEGF、MMPs、ANG-2是已知的重要的活性因子。由于胰腺癌的有效治疗手段非常匮乏,针对胰腺癌新生血管形成及转移的研究具有重要的临床价值,并可能成为胰腺癌治疗的新靶点。由于MUC4分子量大,难以在真核细胞中过表达,这极大的限制了其生物学功能的深入研究。然而MUC4分子在生物起源、基因结构、分子进化、生物学行为等方面也有其自身的特殊性:第一,其由不同生物起源的结构域构成,这些结构域各自保守,互相之间具有相对独立性。第二,目前已有多达24种剪接突变体被发现,并且,这些剪接突变体在胰腺正常或炎性组织中极低表达或不表达,而在胰腺癌中高表达。MUC4/Y为MUC4众多天然剪接突变体中的一个,与全长MUC4(sv0-MUC4)相比,其仅缺少exon 2(TR,串联重复序列)编码区,分子量明显减小,利用慢病毒载体系统可以直接在细胞株中过表达。本研究计划从研究MUC4/Y着手,首先研究其在胰腺癌中的促血管生成及转移作用及可能机制。然后,在此基础上以MUC4/Y为模式分子,利用基因缺失突变技术进一步深入研究MUC4/Y-AMOP结构域的功能。希望本研究能够为深入研究MUC4在胰腺癌发生发展中的作用提供一定的理论基础。同时本实验采用的实验方法,也能够为研究高分子蛋白提供一种全新的思路。目的:通过基因缺失突变技术构建MUC4/Y-deletion AMOP(MUC4/Y-AMOP~△)慢病毒载体,明确MUC4/Y-AMOP~△在胰腺癌细胞中的表达及定位。探讨MUC4/Y在胰腺癌促血管生成及转移中的作用和相关分子机制,及AMOP结构域在其中扮演的角色。进一步为MUC4的研究提供理论及技术依据。方法:1、构建MUC4/Y及MUC4/Y-AMOP~△过表达慢病毒载体系统,感染胰腺癌细胞株,构建MUC4/Y及MUC4/Y-AMOP~△过表达细胞株模型。2、通过荧光定量PCR、western blot、细胞免疫荧光共聚焦成像,明确MUC4/Y和MUC4/Y-AMOP~△过表达效率及其在细胞中的定位。3、通过CCK8,trans-well,tube formation实验,研究AMOP结构域在MUC4/Y在促肿瘤血管新生及转移中的作用。4、通过matrigel plug assay实验在裸鼠体内进一步验证MUC4/Y及AMOP结构域在胰腺癌促血管形成方面的作用。5、通过胰腺原位成瘤模型,观察各组(EV,MUC4/Y,MUC4/Y-AMOP~△)细胞对裸鼠生存的影响。6、通过胰腺原位成瘤模型,比较各组(EV,MUC4/Y,MUC4/Y-AMOP~△)裸鼠体内转移情况。7、通过western blot,免疫荧光,细胞因子活性检测等实验方法,探讨MUC4/Y及AMOP结构域参与胰腺癌恶性生物学的分子机制。结果:1、成功构建并建立了稳定过表达MUC4/Y及MUC4/Y-AMOP~△的细胞株模型。免疫荧光共聚焦成像,显示缺失了AMOP结构域后,并不影响MUC4/Y的定位。2、胰腺癌细胞过表达MUC4/Y后,能够促进HUVECs(脐静脉内皮细胞)的小管形成,增殖,迁移,侵袭等能力。缺失AMOP结构域,可以削弱这种能力。3、缺失AMOP结构域后,同样能削弱MUC4/Y促进胰腺癌细胞迁移、侵袭的能力。4、matrigel plug assay进一步验证了MUC4/Y能够促进胰腺癌新生血管形成。缺失AMOP结构域组,与对照组相比,未观察到明显差异。5、裸鼠胰腺原位成瘤,观察小鼠生存情况,绘制K-M曲线,通过Log Rank(Mantel-Cox)统计P值,比较各组差异。数据结果显示,MUC/Y组相比于对照组与AMOP缺失组,中位时间较短。揭示,AMOP结构域在MUC4/Y恶性生物学行为中扮演着很重要的角色。6、利用胰腺原位成瘤,观察小鼠体内转移情况,统计分析各组小鼠体内器官转移情况。发现MUC4/Y组,小鼠体内器官远处转移率明显高于对照组与AMOP缺失组。揭示AMOP结构域在MUC/Y促肿瘤转移中起到关键作用。7、过表达MUC4/Y后,NOTCH3表达上调,NOTCH信号通路被激活,下游基因表达增强。缺失AMOP后,此种效应消失。充分揭示AMOP结构域在MUC4/Y调控肿瘤体系中具有不可或缺的作用。结论:1、缺失AMOP结构域后,不会影响MUC4/Y在细胞的定位。2、AMOP在MUC4/Y瘤血管新生及转移中,起到至关重要的作用。其相关机制可能为,影响NOTCH3 signalling激活,并调控下游活性基因的表达。3、本实验通过自然存在的剪接突变体作为一种模式分子,研究高分量蛋白的特异性结构域,可能为细胞分子生物学的研究提供一种全新的思路。