滇紫草乌饭和松茸的化学成分及其生物活性的研究

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滇紫草乌饭是尤纳尼(Unani)和阿育吠陀(Ayurvedic)医学系统中的传统草药之一,常被当地人用于制作滋补剂和解热剂,还被用来治疗哮喘、高血压和咽喉疾病等。滇紫草乌饭的提取物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和保护免疫系统等活性,但是这些活性与其化学成分之间的关系却极少有被研究报道。被誉为“食用菌之王”的松茸是一种纯天然的名贵大型真菌,它不仅营养丰富可以作为菜品食用,同时还具有很高的药用价值,例如抗菌、抗肿瘤和抗炎等。松茸中含有大量的多糖物质,对松茸化学成分和生物活性的分析,也主要集中于松茸多糖,而对松茸中小分子化学成分的研究相对较少。本文以滇紫草乌饭和松茸为研究对象,对滇紫草乌饭和松茸的乙醇提取物作了较为系统的分离纯化,研究了提取物和部分化合物的抗氧化活性、对肿瘤细胞生长、炎症因子和SARS-Co V-2病毒的抑制活性,探讨了滇紫草乌饭中的化合物秦皮乙素对嗜水气单胞菌SHAe115的群体感应和生物被膜形成的抑制活性。具体的研究内容和结果如下:(1)滇紫草乌饭和松茸化学成分的分离纯化:将滇紫草乌饭和松茸样品用95%的乙醇浸泡回流提取,浓缩去除溶剂得到粗提物浸膏,用水扩散浸膏,用不同极性有机溶剂多次萃取、浓缩,得到不同提取部位。使用正相硅胶、反相硅胶、MCI、Sephadex LH-20交联葡聚糖凝胶等材料和和高效液相色谱等方法对各个部位分离纯化,通过核磁、质谱等波谱技术解析分离到的化合物。从滇紫草乌饭的乙酸乙酯部位和二氯甲烷部位分离鉴定了37个化合物,其中3个新化合物,其余化合物均为首次从该植物中分离得到;从松茸中分离鉴定了23个化合物,其结构类型涉及酰胺、氨基酸、核苷、甾醇和脂肪烃。(2)滇紫草乌饭、松茸的提取物和化合物的活性评估:通过自由基清除反应、铁离子还原反应评估了滇紫草乌饭不同部位的抗氧化活性,结果显示,滇紫草乌饭的各个提取物部位均具有明显的抗氧化活性,乙酸乙酯部位活性最强。评估提取物和化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用,在肿瘤细胞培养过程中添加不同终浓度的提取物和化合物,通过cell counting kit-8试剂盒(CCK8)检测细胞的生长活力,计算药物对肿瘤细胞的抑制率。实验结果显示,滇紫草乌饭的乙酸乙酯部位活性最好,对HCT116和MDA-MB-231肿瘤细胞的增值均具有明显的抑制作用。在所筛选的化合物中,化合物2、26、32、S11、S14和S15对HCT116肿瘤细胞的增值具有明显的抑制作用,其中,化合物2的活性最好,且对肿瘤细胞的增值具有浓度依赖性,其IC50值为15.06μM。小鼠巨噬细胞RAW 264.7在受到脂多糖(LPS)的刺激后会分泌许多的炎症因子,通过检测加入药物后这些炎症因子m RNA的相对表达量,可以计算出药物对炎症因子的抑制作用。实验结果显示,滇紫草乌饭的乙酸乙酯和二氯甲烷部位能够明显抑制LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞所引起的多种炎症因子的产生,化合物25-28、S11、S14和S15显著抑制了NO的产生。SARS-Co V-2 GFP/ΔN病毒样颗粒只有在修饰了SARS-Co V-2病毒核衣壳基因(N基因)的Caco-2-N细胞中才能够复制增值。在Caco-2-N细胞培养过程中加入各化合物,病毒感染细胞后通过检测培养物中GFP荧光蛋白的信号强度、计算Envelope基因和Spike基因m RNA的相对表达量来确定病毒的增值量。实验结果显示,化合物S14和S15可以明显抑制病毒Envelope和Spike基因m RNA的相对表达量,表明其抑制了SARS-Co V-2 GFP/ΔN病毒样颗粒的复制增值,具有潜在的抗SARS-Co V-2病毒的活性。(3)秦皮乙素对嗜水气单胞菌SHAe 115的群体感应相关毒力因子和生物被膜形成的抑制作用:文献报道滇紫草乌饭和松茸具有抗菌活性,通过对分离得到的化合物进行群体感应抑制(QSI)活性的初步筛选,发现化合物9(秦皮乙素)对嗜水气单胞菌SHAe 115有QSI活性。进一步研究发现,秦皮乙素可以抑制SHAe 115的溶血素、胞外蛋白酶的生成,抑制其swarming运动能力及生物被膜的形成。RT-q PCR实验分析显示,秦皮乙素抑制了该菌鞭毛和生物被膜形成相关基因(ahy I、ahy R、lux S、csg AB和fle Q)的表达水平,增强了负调节生物被膜形成基因(lit R)的表达水平。
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